2-11 环磷酰胺与异环磷酰胺对大鼠肝细胞的毒作用

目的探讨环磷酰胺(CP)与异环磷酰胺(Ifo)对混悬培养大鼠肝细胞的毒性效应及其可能机制.方法以两步灌流法消化成年大鼠肝细胞,并进行混悬培养.CP与Ifo分别以20mmol染毒,观察染毒后30、60、120和180 min肝细胞的存活率、胞内酶泄漏情况以及肝细胞巯基状态、丙二醛(MDA)含量的变化,并对肝细胞表面形态和超微结构进行观察.结果随着染毒时间的延长,两药均引起肝细胞存活率逐渐下降,胞内酶泄漏加重,培养液中乳酸脱氢酶(LDH)、天冬氨酸转氨酶(AST)活性逐渐增高,同时肝细胞总巯基(TSH)、非蛋白巯基(NPSH)、蛋白巯基(PSH)逐渐下降,其中PSH下降在TSH耗竭中起主要作用.两药引起的这些改变CP有比Ifo重的趋势.两药染毒期间肝细胞MDA含量均未发现有显著增高.形态学检查发现CP与Ifo 20mmol染毒180 min均使肝细胞表面出现"大疱”,胞内线粒体肿胀,空泡化,粗面内质网扩张,部分脱颗粒,内腔模糊.结论 CP与Ifo对混悬培养大鼠肝细胞有损伤作用,巯基物质的降低在两药肝细胞毒性中起重要作用.

何首乌肝毒性物质基础探索研究

通过观察何首乌中蒽醌类成分对HepG2细胞的细胞毒作用,并通过精密肝切片技术对细胞毒成分进行验证,探讨何首乌致肝毒性的物质基础.运用MTT法检测何首乌中游离蒽醌、结合蒽醌及柰类共11个单体成分对HepG2细胞的毒性.将有明确细胞毒的成分与大鼠肝切片共同培养6h后制备肝组织匀浆,通过BCA法测定匀浆液中蛋白含量,连续监测法测定并计算每1μg蛋白中丙氨酸氨基转移酶(A LT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、y-谷氨酰氨基转肽酶(GGT)和乳酸脱氢酶(LDH)的漏出率,以考察这些成分对肝组织的毒性作用.细胞试验结果显示,只有大黄酸、大黄素、大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷和大黄素甲醚-8-O-(6'-O-乙酰基)-β-D-葡萄糖苷显示一定的细胞毒作用,其IC50分别为71.07,125.62,242.27,402.32 μmol·L-1,而其他7个化合物的毒性很小.肝切片试验结果显示,大黄酸400 μmol·L-1组能引起肝切片ALT,AST,LDH漏出率的显著升高(P＜o.o1),100μmol·L-1组能引起肝切片LDH漏出率的显著升高(P＜0.05);随药物浓度增大,肝切片中蛋白含量显著下降(P＜0.05),显示有一定的量毒关系.大黄素400 μmol·L-1组可引起肝切片ALT,GGT,LDH漏出率的显著升高(P＜0.01).大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷800 μmol·L-组能引起肝切片ALT,AST,LDH漏出率的显著升高(P＜0.01或P＜0.05),200 μmol·L-1组能引起肝切片LDH漏出率的显著升高(P＜0.05);且随药物浓度的增大肝切片中ALT,AST,LDH漏出率呈升高趋势,蛋白含量呈下降趋势.此外,浓度为800 μmol·L-的大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷还可使肝切片MTT还原能力显著下降(P＜0.01).结果提示,大黄酸、大黄素及大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷只有在高浓度(≥400 μmol·L-1)时才可能对肝组织产生一定的损害作用.但是,据文献报道这3个成分的体内暴露水平都很低,要达到毒性浓度(400 μmol·L-1或800 μmol·L-1)的暴露水平,转化为健康成人至少分别需要单次口服4 898,339,5 581 g的何首乌药材,这与何首乌的临床使用剂量(生首乌3～6g,制首乌6～12g)相差甚远,因此,“蒽醌类成分是何首乌肝毒性成分”这一说法是缺乏科学依据的.

熊去氧胆酸治疗胆汁淤积性疾病应用进展

胆汁淤积是指由于肝胆酸流受阻而导致的血清胆汁酸浓度升高.胆道上皮病变导致胆汁酸转运障碍,增加了血清胆汁酸浓度,普遍特征是胆汁酸在肝脏和血液中蓄积伴胆汁流减少,慢性胆汁淤积肝损伤主要由肝内淤积的高浓度肝细胞毒性疏水胆汁酸(如石胆酸及其前体鹅去氧胆酸)介导,它们溶解胞膜脂质,致胞膜损坏、细胞完整性破坏及胞内成分漏出,并能引发免疫激活介导的肝损伤,以进展性肝内胆酸潴留导致肝损伤、肝硬化和死亡为特征.

异烟肼和利福平致小鼠原代肝细胞损伤时CYP2E1和CYP3A酶活性的变化

目的 研究异烟肼和利福平对小鼠原代肝细胞的损伤作用及对CYP450同工酶CYP2E1和CYP3A酶活性的影响.方法 从小鼠肝脏中分离出肝细胞,原代培养3 d后,加入药物后孵育2 d.收集细胞培养上清液,测定其中的乳酸脱氢酶(LDH)释放量以反映药物对肝细胞的损伤作用.测定CYP450酶活性的细胞分别加入CYP2E1和CYP3A的特异性底物(对硝基酚和咪达唑仑)孵育2 h,反应终止后用高效液相色谱-质谱法测定特异性底物的浓度,浓度减少程度代表CYP2E1和CYP3A活性的变化.结果 与对照组比,异烟肼中、高浓度组,利福平高浓度组,合用中、高浓度组LDH的释放量显著增加.与对照组比较,异烟肼组与合用组CYP2E1底物对硝基酚浓度均显著降低;利福平组与合用组CYP3A底物咪达唑仑浓度均显著降低.结论 高浓度的异烟肼和利福平均对小鼠原代肝细胞有损伤作用,两药合用时,低浓度能引起肝细胞损伤.异烟肼和利福平对CYP2E1和CYP3A酶活性的诱导可能是其导致肝损伤的机制之一.

153 和厚朴酚与厚朴酚对叔丁基氢过氧化物或D-半乳糖胺致大鼠原代肝细胞毒性的防护作用

栀子、连翘等中药配方颗粒体外肝细胞毒性研究

目的:对栀子、连翘、大黄、续断、首乌藤、麻黄、淫羊藿、丹参、地黄、陈皮10种中药配方颗粒的体外肝细胞毒性进行研究评价.方法:以人正常肝细胞LO2为研究对象,设定一系列浓度梯度,MTT法观察不同浓度配方颗粒对LO2细胞的细胞毒作用;Hoechst 33258荧光染色法观察细胞核形态.结果:100、1 000 mg/L栀子配方颗粒对LO2细胞呈现明显毒性作用(P＜0.05或P＜0.01),荧光染色可见明显的核荧光强度增强、固缩等凋亡表现;连翘等其他9种配方颗粒在0.001 ～1 000 mg/L范围内,对LO2细胞无明显毒性作用(P＞0.05),也未观察到明显的细胞核形态学改变.结论:本研究以中药配方颗粒作为体外实验的载体,对栀子、连翘等10种常用中药配方颗粒的早期肝毒性进行了评价,提示栀子配方颗粒若在较大剂量下使用,可能会存在明显的肝脏毒性,其他9种中药配方颗粒对人正常肝细胞LO2无明显毒性,为上述中药配方颗粒的临床应用提供了参考.

苦参碱和氧化苦参碱致HL7702细胞毒性研究

目的:探讨苦参碱和氧化苦参碱在体外对人正常肝细胞( HL7702)的影响.方法:①采用MTP法检测苦参碱和氧化苦参碱对肝细胞活力的影响;②采用光镜对给药后的细胞形态进行观察;③检测给予苦参碱和氧化苦参碱后,肝细胞培养上清液中的肝功能指标(ALT、AST、ALP、LDH).结果:①MTT法显示,2.5～5mg/mL的苦参碱对HL7702细胞有明显的抑制作用(P<0.O1),5 mg/mL的氧化苦参碱能够显著性降低肝细胞活力(P<0.05);②光镜结果显示,给予苦参碱和氧化苦参碱后,细胞出现皱缩,变圆,体积变小,亮度增加,且药物浓度越大,呈现此状态的数目越多,苦参碱对HL7702细胞形态的影响大于氧化苦参碱;(3)5mg/mL的苦参碱和氧化苦参碱均能明显升高细胞上清液中的AST、ALP、LDH水平(P<0.01或P<0.05),相同剂量苦参碱的上清液中AST、ALP、LDH水平的升高程度大于氧化苦参碱.结论:苦参碱和氧化苦参碱对肝脏可能具有毒性作用,且苦参碱的肝毒性作用大于氧化苦参碱.

二甲基甲酰胺所致肝细胞毒性及谷胱甘肽含量的变化

以DMF与大鼠肝细胞体外孵育,观察DMF所致细胞毒性及对肝细胞内GSH含量的影响.发现DMF在短时间内即可使GSH明显下降,细胞死亡率也随着孵育时间和剂量的增加而增加,两者呈负相关.DTT对DMF所致的细胞毒性有明显的拮抗作用.

慢性乙型肝炎患者血清IL-17水平的临床研究

乙型肝炎病毒感染仍然是一种严重影响人类健康的全球性疾病.近年来许多研究都表明HBV本身无肝细胞毒性,然而在HBV感染过程中能激发一系列细胞免疫介导的炎症反应,引起肝细胞损伤,此过程中,多种自身免疫指标可能激活.IL-17作为近年来新出现的细胞因子,在多种自身免疫性疾病的发生、发展中起重要作用[1-2].本研究对30例慢性乙型肝炎(CHB)患者进行血清IL-17检测,探讨IL-17在其发病过程中的作用.资料与方法一、研究对象所有病例均为我院2010年1月至2010年10月的住院患者.其中男性18例,女性12例.年龄14～68岁,平均38.4岁.同时选取30例慢性HBV携带者(ASC组),其中男性17例,女性13例.年龄15～59岁,平均36.8岁.所有患者均排除重叠感染、自身免疫性疾病.诊断均符合2005年中华医学会肝病学分会及传染病学分会制订的《慢性乙型肝炎防治指南》标准[3].

乙型肝炎病毒外膜大蛋白血清学检测及临床意义

HBV的外膜蛋白主要包括主蛋白、中蛋白和大蛋白.大蛋白存在于感染性颗粒(Dane颗粒)和亚病毒管状颗粒上,是病毒形成完整外膜的重要标志,与病毒复制密切相关,对HBV复制过程具有反式激活作用,并与病毒颗粒从细胞内释放有关,过量乙肝病毒外膜大蛋白(HBV-LP)在肝细胞内质网积聚是导致内质网应激的关键因素,并与肝细胞毒性甚至肝癌相关[1,2].有研究表明,HBV-LP具有双重跨膜拓扑结构,这是HBV-LP发挥多种功能作用的依赖性结构,针对HBV LP特殊构象制备的单克隆抗体,可以更准确地检测血清中HBV-LP[3].为进一步了解HBV-LP检测的临床意义,我们对357例HBV感染者血清HBV-LP进行了检测,现将结果报道如下.

microRNA-122作为新药肝毒性早期评价标志物的相关分析

目的:探讨microRNA-122 (miR-122)在新药肝细胞毒性早期评价中的应用价值.方法:建立对乙酰氨基酚诱导的小鼠原代肝脏细胞损伤模型,对细胞培养上清中miR-122含量以及传统细胞毒性标志物乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)含量分别进行测定,对二者进行平行比对和相关性分析,初步探讨miR-122在新药肝细胞毒性早期评价中的作用;采用多种潜在肝脏毒性物质诱发的小鼠原代肝脏细胞损伤模型,进一步验证miR-122在肝细胞毒性早期评价中的应用价值.结果:在对肝细胞毒性早期评价中,miR-122和LDH呈现良好相关性(r＞0.9);与LDH相比,miR-122具有更高的灵敏性.结论:miR-122作为新药肝细胞毒性早期评价标志物具有潜在应用价值.

大黄总蒽醌胶囊的血清药理学研究

目的:建立大黄总蒽醌胶囊血清药理学的研究方法.方法:以细胞增殖力和谷草转氨酶(aspartate transaminase,AST)渗漏为指标建立过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)诱导的HL-7702肝细胞损伤模型,并考察体系中添加不同浓度大黄总蒽醌胶囊含药血清对损伤肝细胞的影响.结果:0.5 mmol/L和2.5 mmol/L H2O2分别为细胞增殖试验和AST渗露检测的适宜造模浓度;体系中添加5％大黄总蒽醌胶囊含药血清损伤肝细胞增殖明显增加(P＜0.05),添加10％ 、20％、40％含药血清损伤肝细胞增殖明显降低(P＜0.01或P＜0.05);体系中添加5％和10％含药血清损伤肝细胞AST渗漏明显减少(P＜0.01),添加20％ 、40％含药血清损伤细胞AST渗漏明显增加(P＜0.01).结论:大黄总蒽醌胶囊含药血清具有肝细胞保护和毒性双向作用,低剂量对损伤肝细胞具有保护作用,高剂量则产生毒性.

紫菀肽类组分诱导肝脏L-02细胞凋亡的机制

探讨紫菀肽类组分Fr-2的肝细胞毒性及其作用机制.采用二甲基噻唑蓝(MTT)检测人正常肝脏L-02细胞的活力,试剂盒检测LDH、ROS、GSH、细胞色素C和Caspase-9、Caspase-3的含量,流式细胞仪检测细胞凋亡率和线粒体膜电位变化,Western blot法检测凋亡相关蛋白p-JNK、Bax、Bcl-2的表达.实验结果显示,紫菀肽类组分Fr-2可剂量/时间依赖性地抑制L-02细胞的生长,诱导细胞内的氧化应激反应,降低线粒体膜电位,促进细胞色素C的释放,升高Bax/Bcl-2的比值并激活Caspase-9、Caspase-3.以上结果表明,紫菀肽类组分Fr-2导致肝细胞毒性的主要诱因是氧化应激,主要作用机制是诱导线粒体依赖途径的细胞凋亡.

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的凋亡诱导机制及其药物开发

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)是TNF超家族成员,它与死亡受体(death receptor,DR)结合,启动细胞内信号途径,特异性诱导肿瘤细胞等凋亡,一般不对机体正常组织产生毒性效应,可望成为新型抗肿瘤药物.然而TRAIL可能的肝细胞毒性严重阻碍其临床应用.本文就TRAIL诱导凋亡的机制及其TRAIL药物开发的前景作一综述.

MTT法观察DMF致人肝细胞增殖抑制作用

目的 观察不同染毒剂量二甲基甲酰胺(DMF)对正常成人离体肝细胞的增殖抑制作用.方法 用MTT比色法观察细胞生长变化,分别以1.56mmol/L、6.25mmol/L、25mmol/L、100mmol/L DMF为染毒剂量,以6h、12h、24h为染毒时间对人肝细胞进行培养.比较在不同时间下,不同染毒剂量组与阴性组的细胞生长率.结果 同一染毒时间组内,不同剂量组的细胞生长变化率结果差异有显著意义(F=27.41、23.86、111.22,P＜0.01),以100mmol/L DMF组细胞增殖率为低,但不同染毒剂量组细胞生长变化率未见明显剂量-效应关系,染毒6h和12h 25mmol/L组的细胞生长变化率高于其他浓度组;同一染毒剂量组内,各不同染毒时间组的细胞生长变化率结果差异有显著意义(F=27.80、29.79、42.47、28.88,P＜0.01),以24h组细胞增殖率为低.结论 与阴性组比较,DMF对细胞增殖有抑制作用;但不同染毒剂量组细胞生长变化率的剂量-效应关系不明显;随染毒时间延长,同一染毒剂量组内细胞增殖活性变化率有下降趋势,有一定染毒时间-效应关系.

SIRT1在丙戊酸对肝细胞毒性中的作用研究

目的：探讨沉默信息调节因子1( SIRT1)在丙戊酸对肝脏HepG2细胞毒性中的作用。方法在HepG2细胞中,丙戊酸(2 mmol·L-1)孵育6、12、24、48 h,或丙戊酸(0．5、1、2 mmol·L-1)分别孵育48 h,通过Western blot方法检测丙戊酸对SIRT1蛋白表达的影响；通过瞬时转染SIRT1表达质粒和si-SIRT1,采用SRB方法,观察对SIRT1基因进行过表达和抑制后,丙戊酸对HepG2细胞毒性的改变情况。结果丙戊酸对SIRT1的表达有抑制作用,且具有时间和剂量依赖性。过表达SIRT1后,HepG2细胞对丙戊酸的毒性敏感性下降,转染前后IC50分别为(4．025±0．47)、(10．87±1．50) mmol·L-1；而干扰 SIRT1后, HepG2细胞对丙戊酸的毒性敏感性增加,转染前后IC50分别为(1．938±0．16)、(0．663±0．05) mmol·L-1。结论丙戊酸可抑制 SIRT1的蛋白表达,并且过表达SIRT1可拮抗丙戊酸对肝细胞的毒性作用。

对比分析朱砂、含朱砂复方对人肝细胞毒性的影响

目的：探讨朱砂、含朱砂复方对人肝细胞毒性的影响。方法应用相关仪器和药物对硫化汞组、万胜化风丹组、朱砂安神丸组、甲基汞组、氯化汞组、廖元和堂化风丹组等对于HL－7702肝细胞存活率的影响进行了检测分析。结果相同汞浸出量和汞含量的廖元和堂化风丹组、朱砂安神丸组、万胜化风丹组、硫化汞组与正常对照组相比，对于HL－7702肝细胞存活率的影响无统计学差异（ P＞0．05），而甲基汞组、氯化汞组与正常对照组相比，对于HL－7702肝细胞存活率的影响具有统计学差异（ P＜0．05）。结论相同汞浸出量和汞含量的廖元和堂化风丹、朱砂安神丸、万胜化风丹、硫化汞对于HL－7702肝细胞存活率的影响小于甲基汞和氯化汞。

孕烷X受体参与AFB1诱导的人肝L02细胞坏死性凋亡

目的 初步探讨孕烷X受体(PXR)对黄曲霉毒素B1(AFB1)诱导肝细胞DNA损伤和坏死性凋亡的影响.方法 采用已构建的PXR高表达L02-PXR和空白载体对照L02-pB细胞;实时荧光定量PCR (qRT-PCR)检测细胞NR1I2和CYP3A4 mRNA水平改变;蛋白免疫印迹(Western blotting)检测细胞内PXR和坏死性凋亡下游效应自噬分子LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ蛋白相对表达含量;双核微核试验(CBMN)检测细胞遗传损伤情况;采用噻唑蓝(MTT)法测定AFB1对细胞活性抑制影响;利用坏死性凋亡抑制剂Nec-1构建坏死性凋亡抑制的细胞模型,验证AFB1诱导的坏死性凋亡的效应.结果 与L02-pB细胞相比,L02-PXR细胞NR1I2 mRNA和PXR蛋白显著上调(均P＜0.001).AFB1显著地诱导L02-pB和L02-PXR细胞中CYP3A4 mRNA上调(均P＜0.05),在L02-PXR细胞中的效应更为明显.与对照组相比,AFB1在5～30 μmol/L呈剂量反应关系诱导L02-pB和L02-PXR细胞的微核率增高(均P＜0.05),L02-PXR细胞更为明显;同时,AFB1明显地诱导两株细胞的核芽率和核桥率,但随AFB1剂量增高都有下降趋势.细胞活性随AFB1浓度(1.875～120 μmol/L)增加呈剂量反应关系抑制(均P＜0.05);且相对于L02-pB细胞,L02-PXR细胞对AFB1处理48 h诱导的细胞活性抑制作用更为敏感(P＜0.05).Nec-1可显著性抑制AFB1诱导的L02-PXR细胞活性抑制率(P＜0.05),然而却不能降低AFB1诱导L02-pB细胞活性抑制率.此外,AFB1显著性诱导L02-pB和L02-PXR坏死性凋亡下游LC3-Ⅱ的上调(均P＜0.05);且与L02-pB细胞相比,Nec-1对AFB1诱导的L02-PXR细胞活性抑制和LC3-Ⅱ上调的抑制效果更为明显(P＜0.05).结论 PXR参与AFB1诱导人肝细胞DNA损伤介导的坏死性凋亡,与PXR促进AFB1诱导CYP3A4基因上调有关.

氯化两面针碱、白花丹素、紫杉醇的体外肝细胞毒性研究

目的:观察氯化两面针碱、白花丹素、紫杉醇在体外对肝细胞的毒性作用.方法:大鼠肝脏经胰蛋白酶和胶原酶消化,进行体外肝细胞培养.经糖原染色法(PAS)鉴定后,采用MTT法检测不同浓度氯化两面针碱、白花丹素、紫杉醇对肝细胞的毒性作用.结果:氯化两面针碱、白花丹素、紫杉醇对肝细胞IC50分别为(3.501 5±0.672),(13.289 1±1.165)和(2.163 9±0.748)mg/L,且高抑制率均超过80%,从而说明氯化两面针碱、白花丹素和紫杉醇均对正常肝细胞有毒性作用.结论:氯化两面针碱、白花丹素、紫杉醇可抑制肝细胞的增殖,对肝细胞有一定的毒性.

腺病毒介导多基因对胆管癌细胞凋亡的诱导和肝细胞毒性损害

目的:研究腺病毒介导的多基因(GM-CSF、B7-1、p53、IL-2)对胆管癌细胞系QBC939凋亡的诱导作用和对正常肝细胞的作用.方法:应用TUNEL细胞凋亡检测法和光镜观察,分析同时含GM-CSF、B7-1、p53、IL-2 4种目的基因的重组腺病毒载体(Ad-multigenes)对胆管癌细胞系QBC939和肝细胞系L02的作用以及对大鼠肝脏的毒性损害.结果:Ad-multigenes与化疗药物顺铂协同,能诱导30%左右的QBC939发生凋亡,并对肝细胞系L02和大鼠肝细胞无明显毒性损害.结论:Ad-multigenes能诱导胆管癌细胞QBC939发生凋亡,且与化疗药物顺铂具有协同增强作用.初步分析对人肝细胞及大鼠肝脏无明显毒性损害,具有一定的临床应用前景.