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二甲基甲酰胺对HL7702肝细胞毒性及线粒体膜电位的影响
目的 观察二甲基甲酰胺(DMF)对HL7702肝细胞的细胞活力、凋亡及线粒体膜电位的影响,探讨DMF引起肝细胞凋亡的可能机制.方法 HL7702肝细胞给予50、100、150、200和250 mmol/L DMF处理,于24 h后检测其细胞存活率,乳酸脱氢酶(LDH)释放量.根据细胞毒性测试结果设置对照组及DMF染毒组(200 mmol/L).流式细胞术检测DMF对HL7702细胞凋亡以及对线粒体膜电位的影响.结果 DMF剂量依赖性地降低HL7702细胞的存活率,其中150、200和250 mmol/L DMF组与对照组相比,细胞存活率明显降低;并且,随着DMF染毒浓度增加,释放至细胞外的LDH的含量增加,与DMF浓度呈正相关.200 mmol/L DMF染毒24 h后,与对照组相比,细胞凋亡率增加,差异有统计学意义(P＜ 0,001),线粒体膜电位降低,差异也有统计学意义(P＜0.001).结论 DMF对HL7702细胞的毒性作用具有剂量依赖性,DMF引起HL7702线粒体膜电位的改变与DMF导致细胞凋亡有关.
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吴茱萸次碱对肝肾毒性的初步研究
目的:探讨吴茱萸次碱Rutecarpine(Rut)在体外对人正常肝细胞(HL7702)、人胚胎肾细胞(HEK293)的影响,采用共培养体系初步比较Rut对肝肾细胞活力的影响,并选用小鼠进行整体验证.方法:①采用MTT法检测Rut在肝肾细胞单独培养或共培养体系中对细胞活力的影响并采用倒置显微镜对细胞形态进行观察;②给予Rut后,检测肝肾细胞培养上清液中丙氨酸转氨酶(ALT),天冬氨酸转氨酶(AST),碱性磷酸酶(ALP),尿素氮(BUN),肌醉(Cr),乳酸脱氢酶(LDH)的变化;③整体实验观察静脉给予Rut对小鼠肝肾功能和组织病理学的影响.结果:①MTT法显示,2,4 μg·mL(-1)的Rut使肝肾细胞活力均下降,且相同浓度下的Rut对肝细胞的抑制作用大于肾细胞;②4 μg·mL(-1)的Rut使肝细胞上清液中的AST,ALP,LDH水平均升高(P<0.01);③整体实验表明,小鼠静脉给予10 mg·kg(-1)Rut 7 d后,血清中的ALP水平有极显著的上升(P<0.01),ALT,AST,BUN,Cr水平只出现升高的趋势,病理学检查发现约1/3的小鼠肝脏出现肝细胞核分裂象增多,仅有1只小鼠肾脏出现嗜碱性病变.结论:大剂量Rut可能对肝肾具有一定的毒性作用,肝肾细胞共培养体系与细胞单独培养体系均可用于药物对细胞的毒性研究.
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用肝肾共培养体系研究细胞毒性的方法学考察
目的 建立肝肾共培养体系,并证明此体系的合理性与可行性 方法 采用MTT法比较川楝素(20、40、80、160 μg/mL)、葛根素(200、100、50、25 μg/mL)、苦参碱(5、2.5、1.25、0.625 mg/mL)、汉防己乙素(50、25、12.5、6.25 mg/mL)在肝肾单独培养和共培养体系中对肝、肾细胞活力的影响.结果 2种体系中:川楝素仅对肝细胞的活力有抑制作用,葛根素对肝肾细胞均无抑制作用,苦参碱对肝细胞活力的抑制程度大于肾细胞,汉防己乙素对肾细胞活力的抑制程度大于肝细胞.结论 用肝肾细胞共培养体系与单独培养体系进行实验得出的结果一致,这2种体系均可用于药物对细胞的毒性研究,其中共培养体系能更好地反映药物对靶器官的选择性.
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PPAR-α激动剂Wy14643减轻肝细胞系氧化应激损伤
目的 探讨过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)-α激动剂Wy14643对过氧化氢(H2O2)诱导HL7702肝细胞损伤的保护作用及其机制.方法 RT-PCR、Western blot分别检测H2O2损伤后HL7702肝细胞PPAR-α mRNA及蛋白表达.Wy14643预孵育细胞,观察其对H2O2损伤HL7702肝细胞活性、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性及NF-κB活化的影响.结果 H2O2可诱导HL7702细胞PPAR-α mRNA及蛋白表达降低,200和300 μmol/L H2O2损伤后蛋白表达量由0.69±0.04分别降至0.48±0.05和0.38 ±0.03(P ＜0.01)；Wy14643能够抑制H2O2诱导的HL7702细胞活性降低、SOD、CAT活性下降及NF-κB的激活.结论 Wy14643减轻H2O2诱导的肝细胞损伤,并增强细胞的抗氧化能力,可能与抑制NF-κB的活化有关.
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RhoC在肝癌细胞生长中的作用及分子机制
目的 研究RhoC在肝癌细胞生长中的作用及分子机制,为抑制肝癌细胞生长寻找分子靶点.方法 构建siRNA-RhoC载体,建立RhoC基因沉默的肝癌细胞株.采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞生长,硝酸银染色检测细胞增殖,平板克隆实验检测细胞克隆形成能力,流式细胞术(FACS)检测细胞周期,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞周期蛋白表达.PcDNA3-RhoC转染肝细胞,建立RhoC高表达细胞株,检测RhoC基因对正常肝细胞生长的影响.结果 siRNA-RhoC载体转染Bel7402细胞后,RhoC基因表达的抑制效率为82.3%.细胞培养第4天,RNAi组吸光度(A)值为0.41±0.10,显著低于Bel7402细胞组(0.73±0.11,P＜0.05)和阴性对照组(0.71±0.07,P＜0.05).此后,RNAi组的细胞增殖速度持续低于Bel7402细胞组和阴性对照组,直到第7天实验结束.RNAi组的细胞核平均银染颗粒数明显少于Bel7402细胞组和阴性对照组(分别为1.23±0.35、3.47±0.93和3.17±0.78,均P＜0.01);G0/G1期细胞显著升高[分别为(73.14±5.93)%、(57.05±5.97)%和(52.99±4.80)%,均P＜0.05];cyclin D1表达下降(分别为0.45±0.21、1.25±0.24和1.12±0.15,均P＜0.05);CDK4表达下降(分别为0.55±0.08、1.18±0.32和1.10±0.29,均P＜0.05);p16表达升高(分别为1.07±0.23、0.36±0.12和0.35±0.13,均P＜0.01);p21表达升高(分别为0.42±0.12、0.17±0.06和0.19±0.08,均P＜0.05).HL7702细胞转染PcDNA3-RhoC质粒后,RhoC 高表达,至转染的第3天,RhoC转染组A值为0.83±0.10,显著高于HL7702细胞组(0.54±0.11,P＜0.05)和空载体对照组(0.58±0.55,P＜0.05).其后,RhoC转染细胞生长速度持续高于HL7702细胞组和空载体对照组,直至第7天实验结束.结论 RhoC是调控肝癌细胞生长的关键分子,是抑制肝癌细胞生长的良好分子靶点.
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苦参碱和氧化苦参碱致HL7702细胞毒性研究
目的:探讨苦参碱和氧化苦参碱在体外对人正常肝细胞( HL7702)的影响.方法:①采用MTP法检测苦参碱和氧化苦参碱对肝细胞活力的影响;②采用光镜对给药后的细胞形态进行观察;③检测给予苦参碱和氧化苦参碱后,肝细胞培养上清液中的肝功能指标(ALT、AST、ALP、LDH).结果:①MTT法显示,2.5～5mg/mL的苦参碱对HL7702细胞有明显的抑制作用(P<0.O1),5 mg/mL的氧化苦参碱能够显著性降低肝细胞活力(P<0.05);②光镜结果显示,给予苦参碱和氧化苦参碱后,细胞出现皱缩,变圆,体积变小,亮度增加,且药物浓度越大,呈现此状态的数目越多,苦参碱对HL7702细胞形态的影响大于氧化苦参碱;(3)5mg/mL的苦参碱和氧化苦参碱均能明显升高细胞上清液中的AST、ALP、LDH水平(P<0.01或P<0.05),相同剂量苦参碱的上清液中AST、ALP、LDH水平的升高程度大于氧化苦参碱.结论:苦参碱和氧化苦参碱对肝脏可能具有毒性作用,且苦参碱的肝毒性作用大于氧化苦参碱.
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蜂胶黄酮对环磷酰胺诱导HL7702细胞损伤的保护作用
目的 探讨蜂胶黄酮(EPF)对环磷酰胺(CTX)诱导HL7702细胞凋亡的保护作用.方法 将HL7702细胞按一定密度分别接种于96孔板和24孔板,培养24 h后,向各孔中分别加入CTX(4 ng/L)、CTX(4 ng/L)+EPF(20、30、40 ng/L),继续培养24 h,进行WST-1、AO/EB双染、Annexin-V-FITC/PI流式细胞染色.采用小鼠随机分组,试验组每天给予EPF 100、200、400 mg/mL灌胃,0.5 mL/支,连续给药10 d,同时注射CTX 0.15 g/kg,共3 d.取血清检测过氧化氢酶(CAT)、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)等活性及尿素氮(BUN)含量.结果 EPF与CTX共处理HL7702细胞生长抑制明显改善,当EPF浓度达到40 ng/mL时,促进生长作用呈现正比例曲线特征.试验组凋亡细胞明显减少,绝大多数细胞形态饱满,几乎没有死亡细胞.CTX单独处理的HL7702细胞组24 h晚期凋亡细胞占30.2%,CTX与EPF共处理细胞组凋亡细胞分别占19.2%、13.1%、7.1%.结论 EPF对CTX诱导的HL7702凋亡作用具有拮抗作用,可缓解CTX引起的毒性.
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RGD活性肽对环磷酰胺诱导HL7702正常肝细胞损伤的保护作用
目的 探讨含RGD序列的抗肿瘤多肽T30肽对环磷酰胺诱导HL7702细胞凋亡的保护作用.方法 将HL7702细胞按一定密度分别接种于96孔板和24孔板,培养24h后向各孔中分别加入环磷酰胺(CTX)(浓度为4μg/ml),CTX+ RGD-T30(浓度依次为20、40、60 μg/ml),继续培养24 h,进行WST-1、AO/EB双染、Annexin-V-FTTC/PI流式细胞染色.结果 RGD-T30肽与CTX共处理HL7702细胞生长抑制明显改善,当RDG-T30肽浓度达到40μg/ml时,促进生长作用呈现正比例曲线特征.RDG-T30肽组凋亡细胞明显减少,绝大多数细胞形态饱满,几乎没有死亡细胞.CTX单独处理的HL7702细胞组24h晚期凋亡细胞占30.2％,CTX与RDG-T30共处理细胞组凋亡细胞分别占19.2％和13.1％、7.1％.结论 T30肽对CTX诱导的HL7702凋亡具有拮抗作用.
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天麻素通过SIRT1/PGC-1α信号通路抗叔丁基过氧化氢诱导的HL7702细胞氧化损伤
目的:探讨天麻素对叔丁基过氧化氢诱导的人肝细胞HL7702氧化损伤的保护作用.方法:以叔丁基过氧化氢损伤人肝细胞HL7702建立氧化损伤模型,以不同浓度天麻素(5～20 μmol/L)进行干预.采用MTT比色法检测细胞活力,光学显微镜观察细胞形态,罗丹明123染色法检测细胞线粒体膜电位改变,免疫印迹实验检测细胞中SIRT1和PGC-1α蛋白的表达.结果:不同浓度天麻素(5 ～20 μmol/L)能够提高叔丁基过氧化氢作用的细胞存活率并呈时间-剂量依赖性,确定其佳作用时间为24h,佳作用浓度为10 μmol/L.与对照组相比,模型组细胞氧化应激作用明显增强,而天麻素10 μmol/L作用24h后,能够显著降低活性氧和丙二醛含量,升高超氧化物歧化酶活力;抑制叔丁基过氧化氢诱导的线粒体膜电位降低并显著增加SIRT1和PGC-1α蛋白的表达.结论:天麻素能够抑制活性氧对HL7702细胞的氧化损伤,其保护作用可能与抑制氧化应激引起线粒体功能损伤并上调SIRT1/PGC-1α蛋白表达有关.
