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EGFP-CD40L 融合基因的构建、表达及功能鉴定
目的 构建编码增强型绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,EGFP)和人CD40L胞外段(hecdCD40L)组成的融合基因真核表达载体,并探讨表达后的融合蛋白对人树突状细胞(dendritic cells, DCs)表型和功能的影响. 方法 以RT-PCR方法从健康人外周血单个核细胞中克隆hecdCD40L基因片段.小鼠血管内皮细胞生长因子受体2信号肽序列(SigmKDR)和EGFP与hecdCD40L基因片段融合或不融合,插入真核表达载体pcDNA3.1(-),构建pcDNA3.1 SigmKDR-EGFP(sEGFP)和pcDNA3.1 sEGFP-hecdCD40L.用脂质体将表达载体转染至体外培养的COS-7细胞后,G418抗性筛选,流式细胞仪分选并检测EGFP和/或CD40L的表达.Western blot检测融合蛋白在COS-7细胞及其上清中的表达,用镍柱和超滤离心管获取纯化浓缩的sEGFP-hecdCD40L和sEGFP融合蛋白与人DCs共孵育,流式细胞仪和ELISA分析DCs对2种融合蛋白的摄取率、DCs表型变化以及细胞因子IL-12的分泌. 结果 pcDNA3.1 sEGFP或pcDNA3.1 sEGFP-hecdCD40L转染COS-7细胞后,经G418抗性筛选和流式细胞仪分选筛选获得高效表达融合蛋白的单克隆细胞株,EGFP阳性细胞可达95%以上,Western blot在细胞内和上清中均能检测到融合蛋白.sEGFP或sEGFP-hecdCD40L与DCs共孵育2 h,流式细胞仪检测示EGFP阳性率前者为28.6%,后者为56.9%,24 h后分析DCs的表型,sEGFP-hecdCD40L融合蛋白增强DCs表面CD80、CD83和HLA-DR分子的表达以及刺激IL-12的分泌,而sEGFP对DCs的表型和IL-12的分泌无明显影响. 结论 用SigmKDR、EGFP和hecdCD40L构建的融合基因能在真核细胞中表达并能分泌至细胞外,这种分泌型融合蛋白能靶向DCs,诱导DCs的成熟和上调其表面共刺激分子和MHC-II分子的表达,并刺激IL-12分泌.
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Peroxiredoxin2基因RNAi慢病毒载体构建及对SW480细胞增殖的影响
目的：构建Peroxiredoxin2（PRDX2）基因RNA干扰（RNAinterference，RNAi）慢病毒表达载体，探讨PRDX2基因干扰后对结直肠癌SW480细胞增殖的影响。方法设计、合成靶向PRDX2的RNA干扰的序列，构建pGC‐EGFP‐shPRDX2慢病毒载体并进行鉴定，同时应用qRT‐PCR和Westernblot方法观察转染的SW480结肠癌细胞PRDX2mRNA和蛋白表达的抑制效果，并通过MTT、平板克隆形成实验检测细胞增殖变化。结果成功构建PRDX2基因慢病毒载体并经测序证实；pGC‐EGFP‐shPRDX2可有效抑制结直肠癌SW480细胞PRDX2的表达，感染慢病毒的SW480细胞中PRDX2mRNA和蛋白表达水平明显降低（P＜0．05）；SW480细胞经PRDX2RNA干扰后其生长和增殖能力显著降低（P＜0．05）。结论PRDX2基因RNAi慢病毒表达载体在SW480细胞中表达稳定可靠，PRDX2基因干扰后有效抑制了结直肠癌SW480细胞的增殖和生长，为进一步探讨PRDX2在结直肠癌发生、发展及转移中的作用奠定基础。
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人β-NGF重组质粒转染GFP转基因小鼠BMSC的实验研究
目的：观察携带有人β神经生长因子（β-NGF）重组质粒的骨髓基质干细胞（BMSC）的生物学特性。方法培养小鼠BMSC ，采用脂质体LipofectamineTM 2000（Lip2000）转染方法将含有人β-NGF基因的重组质粒转染至含有绿色荧光蛋白（GFP）基因的小鼠BMSC中，利用酶联免疫吸附测定（ELISA）的方法检测其β-NGF蛋白的表达水平。结果采用脂质体Lip2000转染方法能成功地将β-NGF重组质粒转染至BMSC ，转染后细胞出现β-NGF基因的表达，并且其表达的β-NGF蛋白能有效地保护转染过程中对细胞的损害。结论经转染后携带β-NGF基因质粒的小鼠BMSC仍有增殖、分化能力，并且具有了β-NGF蛋白的表达能力。
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PINCH-1基因RNAi慢病毒载体的构建及鉴定
目的 构建人PINCH-1基因的RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,并转染人骨髓基质细胞初鉴定转染效果.方法 利用RNAi设计软件,设计合成针对人PINCH-1基因的特异性siRNA序列,利用酶切反应合成包含特异性shRNA序列的pGCSIL-GFP慢病毒载体GC-shBC047440,通过GC-shBC047440与pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体共转染包装293FT细胞产毒,并利用GFP蛋白表达水平进行滴度测定.获取的病毒上清筛选适感染复数(MOI值),并感染骨髓基质细胞,RT-PCR和Western blot检测重组慢病毒对骨髓基质细胞PINCH-1蛋白和RNA表达的影响.结果 酶切鉴定证实成功构建针对人PINCH-1基因的RNAi慢病毒干扰载体GC-shBC047440,载体感染人骨髓基质细胞后PINCH-1 RNA表达较未感染组和空载体对照组显著下降.结论 成功构建针对人PINCH-1基因的RNAi慢病毒载体,该载体能有效沉默PINCH-1基因的表达.
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重组质粒pαACP-HSP70的特异性表达研究
目的 观察重组质粒pαACP-HSP70在晶状体组织和非晶状体组织中的表达情况,探讨重组质粒pαACP-HSP70的特异性表达.方法 以晶状体组织作为A组,肺小细胞癌细胞A549、肝癌细胞7402等非晶状体组织作为B组,采用阳离子脂质体转染法将pCMV-HSP70质粒、pαACP-HSP70质粒导入A、B组后,通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况.结果 转染pCMV-HSP70质粒到A、B组24 h后发现,两组均有绿色荧光;另外,转染pαACP-HSP70质粒24 h后仅在A组能观察到绿色荧光.结论 重组质粒pαACP-HSP70不能在非晶状体组织表达,仅能在晶状体上皮细胞表达,具有组织特异性.
关键词： 晶体 α晶体蛋白A链 HSP70热休克蛋白质类 绿色荧光蛋白质类 特异性 -
腺相关病毒-1介导增强型绿色荧光蛋白基因在大鼠角膜基质细胞体内外转染的研究
目的:探讨血清1型腺相关病毒(rAAV1)介导增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因体内、外转染大鼠角膜基质细胞后绿色荧光蛋白(GFP)的表达及转染率.方法:采用携带绿色荧光蛋白报告基因的血清1型腺相关病毒(rAAV1-EGFP)感染原代培养的SD大鼠角膜基质细胞,通过荧光显微镜和流式细胞仪观察和检测EGFP的表达及阳性率.建立大鼠异体角膜移植模型,用含rAAV1-EGFP转染液的培养基在37℃孵育SD大鼠角膜植片同时浸泡缝线18h,再用此缝线间断缝合,将植片移植到大鼠角膜植床,术后通过荧光体视镜观察Wistar大鼠角膜出现EGFP荧光的起始时间及分布情况.结果:按rAV1-EGFP不同转染倍数(MOI)转染角膜基质细胞.转染后3d,在倒置荧光显微镜下观察到角膜基质细胞的细胞质有GFP阳性表达.体视荧光显微镜观察到大鼠角膜中开始有GFP阳性表达;随MOI值的增高而增强,转染后7～9 d达到高峰,此时检测rAAV1-EGFP对角膜基质细胞的转染效率,MOI=103时是16.3%,MOI=104时是30.3%,MOI=105时是43.6%,MOI=106时是47.5%.rAAV1-EGFP在大鼠角膜中的表达也明显增强.结论:rAAV1-EGFP可以在体内外稳定、有效转染大鼠角膜基质细胞,是角膜基质细胞理想的报告基因.
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质粒重组体在体转染大鼠心肌的可行性
目的:探讨应用阳离子脂质体lipofectamine2000在体转染质粒重组体基因至大鼠心肌的可行性. 方法:构建含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的真核表达质粒. 将 22只雄性SD大鼠随机分为4组:阴性对照组(Ⅰ组,n=4),心肌注射组(Ⅱ组,n=6),尾静脉注射组(Ⅲ组,n=6)和冠状动脉灌注组(Ⅳ组,n=6).分别采用心肌局部注射、尾静脉液压注射、冠状动脉灌注三种不同方式实施在体心肌转染. Ⅱ～Ⅳ组于转染后2,14 d时间点各随机处死3只大鼠,阴性对照组各处死2只大鼠,取心肌组织作快速冰冻切片,荧光显微镜下观察EGFP表达情况. 结果:在荧光显微镜下观察EGFP表达情况,阴性对照组隐约可见淡绿色荧光,第2天各转染组均可见明显的绿色荧光分布于所取心脏组织. 各转染组荧光强度与阴性对照组相比,其差异均有统计学意义(P＜0.05).心肌注射组和尾静脉注射组间荧光强度差异无统计学意义(P=0.17). 冠状动脉灌注转染组荧光强度较其余两组增强7.37倍(P=0.013). 第2周转染各组荧光强度明显减弱,与阴性对照组差异无统计学意义(P=0.41). 结论:阳离子脂质体lipofectamine2000可有效的将质粒重组体通过各种方式转染心肌组织,而通过冠状动脉灌注转染可以明显提高其转染效率.
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非病毒载体负载增强型绿色荧光蛋白转染永生化神经前体细胞
目的:寻找能高效转染永生化神经前体细胞(INPC)的非病毒载体,观察转染后增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达.方法:用阳离子脂质体Lipofectamine 2000,TRANSfection或阳离子聚合物Sofast分别负载质粒EGFP-C1转染INPC,利用荧光显微镜检测转染后24 h的转染效率.对转染效率高的一种载体,观察其转染后12,24,48和72 h转染效率,确定EGFP表达高峰.用台盼蓝排斥试验检测转染和未转染细胞的活力.质粒EGFP-C1转染INPC后,经G418筛选,挑选细胞克隆,命名为INPC/EGFP,观察其EGFP阳性率.应用巢蛋白抗体鉴定INPC/EGFP.50 mL/L胎牛血清诱导INPC/EGFP分化,观察分化后细胞的形态及EGFP表达.结果:Lipofectamine 2000,TRANSfection和Sofast转染INPC后24 h,转染效率分别为(25.5±2.9)%,(4.0±1.7)%,(7.9±1.4)%.Lipofectamine 2000的转染效率高.其转染后12,24,48和72 h的转染效率分别为(17.1±0.7)%,(25.5±2.9)%,(19.4±0.9)%,(15.6±1.4)%,EGFP在转染后24 h表达高.INPC/EGFP中,EGFP阳性率约为95%.INPC/EGFP巢蛋白表达阳性,其分化后呈神经元或星形胶质细胞样,且胞体及突起中仍可见绿色荧光.结论:Lipofectamine 2000可高效转染INPC.EGFP是INPC理想的示踪方法之一.
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融合蛋白HSP70-EGFP的表达、纯化及其在树突状细胞内化抗原中的应用
目的:研究树突状细胞(DCs)对热休克蛋白70(HSP70)融合蛋白的内化作用.方法:首先原核表达并分离纯化HSP70和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的融合蛋白HSP70-EGFP.实验中所用DCs来源于人外周血.内化实验分3组进行:将1,2组DCs分别与融合蛋白HSP70-EGFP和蛋白EGFP孵育30 min;第3组先将DCs与HSP70孵育30 min,再与HSP70-EGFP孵育30 min.之后将3组DCs转至37 ℃孵箱内,培养0.5,1,2和24 h,应用流式细胞仪检测含HSP70-EG-FP或EGFP的DCs数量.应用IL-12 Eli-spot法检测HSP70-EGFP等抗原促进DCs分泌IL-12的效果.结果:①成功获得了重组蛋白HSP70-EGFP,Mr约为97 000,HSP70-EGFP表达量占总蛋白的35.7%.纯化后的融合蛋白HSP70-EGFP溶液经紫外线灯照射时发出鲜绿色的荧光.②流式细胞仪检测结果显示在37 ℃孵育0.5 h后,HSP70-EGFP孵育的DCs组阳性率为63.3%,其余两组为阴性.在37 ℃孵育1,2和24 h后,3组阳性率均大于80.0%.IL-12 Eli-spot检测结果显示,在刺激DCs活化及分泌IL-12的水平上,HSP70-EGFP与脂多糖(LPS)之间的差别无统计学意义(P＞0.05),而HSP70-EG-FP的活化DCs能力明显高于EGFP(P=0.001).结论:①受体介导的吞噬作用在DCs内化HSP70-EGFP的初始阶段起主要作用,随孵育时间的延续,吞饮作用占主要地位.②HSP70-EGFP可促进DCs分泌特征性细胞因子IL-12.
