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增强型绿色荧光蛋白转染猪骨髓间充质干细胞特性观察
目的:借助质粒将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因转染猪骨髓干细胞(MSC),观察转染后EGFP在(MSC)内表达情况及MSC生长特性.方法:1月龄小型香猪为MSC供体,EGFP基因转染MSC,计算转染效率,流式细胞仪鉴定G418筛选后EGFP基因稳定表达率和转染后细胞增殖周期改变.结果:转染率为(36.9±3.4)%;G418筛选后EGFP表达率75.6%,EGFP转染MSC G0/G1期MSC比例较对照组明显增加(P<0.01),S+G2/M期MSC比例减少(P<0.01).结论:猪MSC经基因转染和G418筛选,获得EGFP稳定表达;转染和G418筛选后MSC增殖能力降低,G0/G1期MSC比例增加,S+G2/M期MSC比例下降.
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人脐带血间充质干细胞的体外培养及其影响因素
背景:多潜能间充质干细胞在特定的培养条件下可以分化为骨、脂肪、软骨、肌肉以及内皮细胞,是目前倍受关注的一类具有多向分化潜能的组织干细胞.目的:建立人脐带血来源的间充质干细胞体外培养、扩增的方法,并分析其影响因素.设计:随机对照实验.单位:无锡第三人民医院组织工程和细胞生物学研究室.材料:健康新生儿脐带血(来源于无锡第三人民医院妇产科临产室,均征得产妇及其家属同意)70例,每例40 mL;低糖基本必需培养基(Gibco),胎牛血清(Gibco),青链霉素(Gibco),胰蛋白酶(Gibco),FITC标记的小鼠抗人CD29、CD105、CD106(Ancell)单克隆荧光抗体和PE标记的小鼠抗人CD34、CD44、CD45、CD19、HLA-DR(Immunotech)单克隆荧光抗体,Ficoll分离液(Pharmacia).方法:实验于2005-02/2005-12在无锡第三人民医院组织工程和细胞生物学研究室完成.①脐血间充质细胞的分离培养:健康新生儿脐带血共70例肝素(25 u/mL)抗凝,分离单个核细胞,其中60例沉淀细胞用细胞培养液(低糖基本必需培养基+50 g/L胎牛血清+10 g/L青链霉素)重悬,另10例用高糖基本必需培养基重悬(其余培养条件相同).细胞长到80%融合时,以1.0×107个/L的密度接种于培养瓶中进行扩增培养.②胎牛血清包被对人脐血间充质干细胞贴壁率的影响:取生长状态良好、纯化后对数生长期的人脐血间充质干细胞,分为血清包被组和无血清包被组,分别观察其贴壁率.③间充质干细胞的形态学和生长曲线:在相差显微镜(OLYMPUS CK40)下观察细胞生长状况,数码成像系统(OLYMPUS DP50)摄像记录.④免疫表型:取扩增第5代的脐血间充质干细胞,用EPICS-ALTRA流式细胞仪进行检测.主要观察指标:①观察高糖组和低糖组细胞的生长状态.②观察不同时间点胎牛血清包被组与未包被组细胞的贴壁情况并分别计算贴壁率.结果:本实验总共培养和分析了70例脐血间充质干细胞样本.由于10例予含高糖的培养基培养的标本均未获得理想的间充质干细胞,故未进行统计学分析.①按照本实验所建立的培养体系,约20%的样本成功培养出脐血间充质干细胞.原代细胞在培养2周后可达到融合,一般其倍增时间为3～4 d,传代后7～8 d即可达到融合.②扩增至第5代的间充质干细胞结果显示,脐血间充质干细胞均一稳定地表达间充质干细胞相关的抗原标记:CD29,CD44,CD105,但不表达CD34,CD45,CD106,HLA-DR,这与源于骨髓的间充质干细胞的表面抗原标记相一致.③血清包被组间充质干细胞贴壁率显著高于无血清包被组(P＜0.01).结论:脐带血中的间充质干细胞可在体外培养、扩增,能够作为间充质干细胞的一种有效来源.高糖可能抑制人脐血间充质干细胞的生长和扩增.
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自体骨髓间充质干细胞治疗脊髓损伤疗效观察
目的:观察自体骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤患者的近期疗效及其安全性.方法:选择2005-04/2006-02在山东省残疾人康复中心住院的脊髓损伤患者24例,采用随机表法分为治疗组和对照组.患者知情同意并签署知情同意书.治疗组11例,对照组13例,均经CT或MRI确诊并行手术治疗.两组在年龄、病程、损伤程度(ASIA分级)等方面均具有可比性(P＞0.05).治疗组在综合康复治疗的基础上给予自体骨髓间充质干细胞治疗,经髂骨穿刺采集自体骨髓156～180 mL,分离提取骨髓间充质干细胞后经静脉途径和/或蛛网膜下腔1次性或分次注射.对照组仅给予综合康复治疗.两组均于入院当天、治疗后7,15,30,60,90 d进行运动与感觉、日常生活能力、膀胱功能评定.结果:24例患者均进入结果分析.①治疗组11例患者均有不同程度的感觉、运动和自主神经功能改善,与对照组比较,差异不显著.②治疗组ASIA分级A级8例,有2例在第60天、1例在第90天评估中恢复为B级.C级1例,在第30天评估中恢复为D级,第90天评估中恢复为E级,能独立行走,生活完全自理.D级2例,其中1例在第90天评估中恢复为E级.对照组A级9例,1例在第90天评估中恢复为B级.B级1例,治疗后无变化.C级2例,1例在第90天评估中恢复为D级.③骨髓间充质干细胞移植常见的不良反应包括低热(7/11例)、头痛(2/11例)、腹胀(1/11例),其中1例于蛛网膜下腔注射后出现双下肢麻木和脑膜刺激征,均于两三天内自行消失.结论:骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤近期有一定疗效而且安全,但远期疗效有待于进一步观察.
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兔骨髓间充质干细胞表面抗原检测及其变化特点
目的:应用流式细胞仪对兔骨髓间充质干细胞的表面抗原进行检测,观察骨髓间充质干细胞传代次数、克隆纯化与骨髓间充质干细胞表面抗原表达之间的关系.方法:实验于2004-01/2006-08在浙江省医学科学院生物工程所完成.取3月龄新西兰大白兔用于骨髓间充质干细胞的分离培养.兔骨髓间充质干细胞的克隆化:将铺满培养瓶底的原代骨髓间充质干细胞,用D-Hanks液小心的洗1次,加入0.25%胰蛋白酶消化约4 min,弃消化液,加LG-DMEM培养液收集细胞,1 000 r/min,离心10 min,然后用LG-DMEM培养液充分混匀沉淀细胞.细胞计数后以10倍递减稀释至细胞密度为103个/mL.取0.1 mL稀释后的细胞悬液加入10 mL培养液,使终细胞密度为10个/mL.将细胞悬液加入96孔培养板,每孔100 μL.置37℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度条件下培养,每天观察克隆细胞的增殖生长状况.待克隆细胞生长至60%～80%融合时,逐步扩大培养,在液氮冻存保种的同时进行细胞连续传代.将体外普通法分离的骨髓间充质干细胞第5代、第7代、第13代、第16代、第21代、第22代及克隆纯化的骨髓间充质干细胞第3代、第5代、第15代、第26代均标记上CD14-FITC及CD44-PE,通过流式细胞仪检测其阴性率及阳性率.结果:①普通法分离的骨髓间充质干细胞各代的CD44表达呈阳性,且随着培养代次的增加,其表达的阳性率逐渐增强,到P16代以后又呈下降趋势;各代骨髓间充质干细胞表面抗原CD14出现了微弱阳性,但随着培养代次增加,其阳性率呈下降趋势.②克隆纯化的骨髓间充质干细胞其CD44呈现阳性,表达在80%以上,至P26代时CD44表达下降到70.49%;其CD14基本呈阴性.结论:兔骨髓间充质干细胞其CD44呈阳性表达,CD14呈阴性表达.随着传代代数增加CD14阴性符合率逐渐提高,CD44阳性表达率也提高.普通法分离的骨髓间充质干细胞较克隆纯化的骨髓间充质干细胞CD14阴性符合率差,前者的CD44阳性表达率也较后者低.
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抗人间充质干细胞单克隆抗体的制备及生物学特性研究
目的:制备抗人间充质干细胞(hMSCs)的单克隆抗体,为鉴定、分选hMSCs奠定基础.方法:以多供体hMSCs免疫BALB/C小鼠,采用杂交瘤技术制备单克隆抗体,并以间接免疫荧光法、免疫组织化学法和流式细胞术等检测单克隆抗体在细胞及组织中的表达.结果:建立了5个能分泌抗人间充质干细胞的单克隆抗体杂交瘤细胞株,该组单抗能与人间充质干细胞特异性结合,而对所检测的人间充质和非间充质来源的组织和细胞均未见交叉反应,5个单抗的相对亲和力分别为:ZUB1 1×106、ZUB4 1×105、ZUC3 1×106、 ZUE12 1×105、ZUF10 1×105;表位分析:ZUB1、ZUE12、ZUF10针对相同的表位,ZUC3和ZUB4则分别针对不同的表位.流式细胞分析显示分离培养的hMSCs阳性表达率为ZUB1 87.39%、ZUB4 88.07%、ZUC3 88.12%、ZUE12 69.89%和ZUF10 83.67%.结论:5株杂交瘤分泌的单克隆抗体均能与人间充质干细胞发生特异性结合,为深入研究hMSCs的生物学功能奠定了基础.
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霉酚酸对人骨髓来源间充质干细胞的作用
目的:研究霉酚酸( mycophenolic acid,MPA)对人骨髓来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的作用及其机制.方法:在MSCs生长和分化过程中加入不同浓度的MPA,用CCK-8方法分析MSCs增殖的情况,用Annexin V/PI双染色法检测MPA各浓度组的细胞凋亡,RT-PCR方法分析MSCs次黄嘌呤核苷酸脱氢酶(IMPDH)的表达；应用von Kossa染色、钙定量和real-time PCR方法分析MPA对MSCs成骨分化的影响.结果:1～100 μmol/L的MPA呈时间浓度依赖性地抑制间充质干细胞的生长,添加鸟嘌呤核苷可以解除该抑制效应,且该抑制效应与细胞凋亡无关；RT-PCR结果显示,MSCs表达IMPDH I和IMPDH Ⅱ两种亚型；yon Kossa染色和钙定量显示,MPA抑制MSCs的成骨分化,Osteopontin和BMP-2的表达相应减低；进一步研究发现,MPA可能通过影响转录因子Runx2、Osterix的表达而影响MSCs的成骨分化.结论:MPA通过耗竭鸟嘌呤核苷的方式呈时间浓度依赖性抑制人骨髓来源的间充质干细胞的增殖；同时,MPA通过抑制Runx2和Osterix蛋白的表达,抑制MSCs的成骨分化.
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基于间充质干细胞的小分子化学药物肿瘤靶向递送系统研究进展
近年来,大量研究通过细胞内化或细胞膜结合的方式将生物大分子或小分子化学药物负载于间充质干细胞(MSC)上,利用其天然的肿瘤归巢特性实现药物的靶向递送,继而通过在靶部位药物的释放或基因表达,达到肿瘤治疗的目的.基因修饰MSC的研究较为成熟,而递送小分子化学药物的研究起步较晚.本文从MSC肿瘤迁移机制、细胞注射后体内分布特点入手,总结了MSC在小分子化学药物肿瘤靶向递送中的研究;同时介绍了MSC与原型药物、载药纳米粒构建的复合系统的载药、释药过程,展望了该系统遇到的挑战和应用前景.
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肌腱干细胞与骨髓间充质干细胞促进髌腱愈合的对比研究
目的:观察肌腱干细胞(TDSC)和骨髓间充质干细胞(BMSC)对大鼠缺损髌腱的修复作用.方法:从SD大鼠的髌腱及骨髓组织中,分离出TDSC和BMSC并培养,分别联合纤维蛋白胶移植到大鼠髌腱缺损模型中.60只SD大鼠分为以下三组:TDSC组采用TDSC+纤维蛋白胶;BMSC组采用BMSC+纤维蛋白胶;对照组采用纤维蛋白胶.术后1、2、4、6、8周检测移植物的大体外观形态、组织学变化及生物力学指标.结果:术后8周TDSC组、BMSC组髌腱缺损基本消失,对照组仍可见髌腱缺损边界.术后8周TDSC组、BMSC组均可见类似肌腱样组织;对照组见肉芽组织增生,细胞排列紊乱,组织杂乱无序.随着时间增长各组的大应力、大应力百分比和弹性模量、弹性模量百分比均增加(均P ＜0.05);在各个时间点,TDSC组、BMSC组的大应力和弹性模量均高于对照组(均P＜0.05).在2周时,TDSC组的大应力百分比和弹性模量百分比均高于对照组(均P＜0.05);TDSC组、BMSC组在4、6、8周时大应力百分比和弹性模量百分比均高于对照组(均P ＜0.05),TDSC组与BMSC组差异无统计学意义(P＞0.05).8周时,TDSC组与BMSC组的弹性模量百分比差异有统计学意义(P＜0.05).结论:同种异体TDSC联合纤维蛋白胶可促进肌腱早期愈合、改善肌腱的生物力学特性,并且其弹性模量优于BMSC联合纤维蛋白胶,提示TDSC能更好地促进肌腱损伤的早期修复.
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兔脂肪干细胞的体外成脂成骨诱导及BrdU标记情况的初步研究
目的 探索兔脂肪间充质干细胞体外分离培养的方法及生物学特性,并探讨5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU) 标记脂肪间充质干细胞的效果.方法 取兔颈后脂肪采用胶原酶消化方法分离培养干细胞,诱导培养基定向成脂、成骨细胞诱导及组织化学鉴定.采用BrdU法标记干细胞, 免疫组化法鉴定其体外标记情况.结果 兔脂肪组织中可以分离培养出生长旺盛的干细胞,定向诱导后表现出成脂,成骨细胞的特性.BrdU可标记干细胞的核,体外标记率达95%.结论 兔脂肪干细胞易于体外分离培养,具有较强的自我更新能力及多向分化的潜能.BrdU对脂肪干细胞的标记效果满意,操作简单易行.
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大鼠骨髓间充质干细胞在体外向神经元样细胞的分化
目的探讨2-ME与BHA对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为神经元样细胞的作用.方法大鼠股骨中分离MSCs,贴壁法体外扩增、传代.以二巯基乙醇(2-ME)预诱导,再加入2-ME、3-叔丁基-4羟基茴香醚(BHA)诱导.免疫细胞化学染色检测巢蛋白(nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、微管联合蛋白-2(MAP-2)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、乙酰胆碱酯酶(AchE)、γ-氨基丁酸(GABA)、酪氨酸羟化酶(TH)的表达,以鉴定分化细胞的表型特征.尿嘧啶脱氧核苷(BrdU)作为细胞分裂标记检测MSCs增殖特性.结果细胞诱导后具有神经细胞的形态, 并被BrdU标记,nestin、NSE、MAP-2、AchE、GABA表达阳性,而GFAP、TH表达为阴性.结论 2-ME和BHA在体外能够有效的诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞.
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体外诱导人骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化
目的探索在体外诱导人骨髓间充质干细胞(hMSC)向心肌细胞分化的方法.方法以5-杂氮胞苷(5-Aza)对hMSC诱导,利用结蛋白抗体、房性利钠肽抗体以及闰盘蛋白抗体进行免疫组化染色,并进行超薄切片透射电镜观察.结果经反复多次传代后,细胞形态及抗原表达无改变,始终保持未分化状态和稳定扩增.利用5-Aza对其诱导后第2周始,免疫组化染色发现细胞结蛋白、闰盘蛋白以及房性利钠肽表达均为阳性,不同浓度5-Aza诱导组之间差异无显著性.电镜观察发现这些细胞具有心肌细胞的特点.结论在体外利用5-Aza可以诱导hMSC向心肌细胞分化.
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骨髓间充质干细胞的生物学特性及其向心肌样细胞的分化
目的 体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),分析其生物学特性;5-氮胞苷(5-Azacytidine, 5-aza)定向诱导其向心肌细胞分化.方法 采用体外密度梯度离心法分离培养大鼠骨髓单个核细胞,流式细胞仪检测细胞表面标志;用含有5-aza(10 μmol/L)目的培养液培养第二代MSCs 24 h,诱导其向心肌细胞分化;诱导4周后采用免疫荧光技术检测心肌细胞特异性标志物Connexin 43和TroponinⅠ目的表达.结果 体外分离培养目的细胞形态主要为纺锤形和长梭形,细胞表面抗原CD29、CD44表达为阳性,CD34、CD45表达为阴性;经5-aza诱导后细胞表达心肌细胞特异蛋白Connexin 43和TroponinⅠ.结论 MSCs是存在于骨髓中目的多能干细胞,体外经5-aza诱导可以定向分化为心肌样细胞.MSCs为心血管疾病目的治疗提供了种子细胞.
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不同浓度血清对大鼠骨髓间充质细胞向胰岛β细胞诱导分化的影响
目的 观察血清不同浓度对乳鼠骨髓间充质干细胞(MSC)诱导分化的影响,检测胰腺相关因子的表达变化.方法 建立骨髓间充质干细胞培养方法,通过RT-PCR检测胰十二指肠同源性盒因子-1(PDX-1)和insulin的mRNA的表达变化,及免疫荧光检测PDX-1和insulin蛋白表达情况.结果 高血清培养基和细胞因子能诱导MSC增殖分化,与对照组比较,PDX-1 mRNA在20％、25％ FBS组中增高分别为2.71和2.58倍(P＜0.05)；insulin mRNA在20％和25％ FBS组中增高分别为1.83和1.77倍(P＜0.05)；免疫荧光显示在MSC共表达PDX-1和insulin蛋白增强.结论 高浓度血清能促进大鼠MSC表达胰腺相关基因,提示MSC需要不同微环境条件的刺激向胰腺细胞分化,为采用干细胞治疗糖尿病提供资料.
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CFSE标记对兔骨髓间充质干细胞生物学特性的影响
目的 探讨荧光染料羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记兔骨髓间充质干细胞(Rb-MSCs)的条件及其对Rb-MSCs生物学特性的影响.方法 用全骨髓贴壁法分离纯化Rb-MSCs并进行鉴定；CFSE在不同条件下标记Rb-MSCs,流式细胞仪检测标记率及荧光强度；CCK-8法检测标记细胞的增殖能力,成骨成脂诱导检测标记细胞的分化能力,ELISA法检测标记细胞分泌血管内皮生长因子(VEGF)的能力.结果 原代Rb-MSCs呈梭形,集落样生长；传代后细胞变为形态均一,排列有序的成纤维细胞样,流式细胞仪检测其表面标志物符合MSCs表型.与其它标记条件相比,10 μmol/L终浓度CFSE标记Rb-MSCs 10 min,标记率达100％,且荧光强度高.标记细胞的增殖能力及分泌VEGF的能力与未标记细胞相比,差异无统计学意义(P＞0.05)；且标记细胞具有成骨及成脂的分化能力.结论 CFSE标记Rb-MSCs是一种简单且高效的方法,适用于短期标记.且标记后Rb-MSCs的增殖能力、分化能力及分泌能力不受影响.
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SHH基因转染大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究
目的 探讨SHH基因转染大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)的可行性.方法 利用电转法将SHH基因转染人大鼠骨髓间充质干细胞,在荧光显微镜下观察转染效率；分别绘制未转染及转染SHH基因后细胞生长曲线,观察转染对细胞的影响；采用PCR、RT-PCR、Western-blot检测转染后骨髓间充质干细胞中外源性SHH基因的表达情况.结果 生长曲线显示转染后骨髓间充质干细胞生长曲线指数生长期及平台期延后,在转染后第12天与未转染达到一致.转染后48 h(即将用于移植前),经荧光倒置显微镜观察转染效率为30％,PCR检测转染后骨髓间充质干细胞中SHH表达较未转染细胞明显升高,实时定量PCR检测其升高约7倍左右,通过Western-blot检测转染后SHH蛋白产物表达明显升高.结论 电转法能够有效将外源性SHH基因转染人大鼠MSC并能获得有效表达,为进一步大鼠缺血性心脏病模型的在体基因治疗提供了前提基础.
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神经干细胞与骨髓间充质干细胞混合培养的实验研究
目的 探讨神经干细胞与骨髓间充质干细胞混合培养对神经干细胞分化为神经元的影响.方法 将纯化的神经干细胞和骨髓间充质干细胞混合培养,观察神经干细胞的分化状态,应用免疫细胞化学技术对培养细胞及其分化细胞进行鉴定.结果 共培养组中36.35%±4.63%的细胞表达神经元特异性蛋白NSE,明显高于对照组中12.78%±6.91%的表达率.结论 骨髓间充质干细胞能提高神经干细胞分化为神经元的比例,还能延长神经元的存活时间.
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Snail在非小细胞肺癌中的表达与上皮-间质转化的相关性及临床意义
目的 研究转录因子Snail、上皮-间质转化(EMT)的标记分子在非小细胞肺癌(NSCLC)组织中的表达及其与肺癌发生、侵袭、转移的相关性,探讨它的临床意义.方法 采用免疫组织化学的方法检测64例NSCLC组织和15例癌旁正常肺组织中Snail、上皮源性标记物E-cadherin、间质源性标记物Fibronectin的表达,并与患者临床病理资料作对照分析.结果 NSCLC组织中Snail表达阳性率为40.6％ (26/64),癌旁肺组织中Snail表达阳性率13.3％(2/15)(P＜0.05).肺癌组织中30例观察到E-cadherin表达的缺失(46.8％),12例观察到胞浆内Fibronectin的阳性表达.Snail、E-cadherin、Fibronectin的表达与肺癌的淋巴结转移、远处转移外侵(P＜0.01)有关.结论 Snail在NSCLC组织中阳性表达,并与EMT的标记蛋白密切相关,可能通过调控上皮-间质转化而在肺癌发生、侵袭、转移过程中发挥作用.
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骨髓间充质干细胞支持脐血造血干/祖细胞体外扩增的研究
目的 体外分离培养人新鲜脐血(UCB)造血干细胞(HSC),利用骨髓问充质干细胞作为滋养层联合细胞因子组合以扩增脐血造血干/祖细胞.方法 采用Ficoll淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离UCBHSC,加入骨髓问充质干细胞和细胞因子,检测脐血造血干/祖细胞总有核细胞(NC)总数和CD34+细胞数.结果 有核细胞总数扩增(75.2±15.0)倍,CD34+细胞数扩增(18.7±12.3)倍.结论 体外HSC培养,加入骨髓问充质干细胞和细胞因子对造血干/祖细胞增殖有明显的作用.
