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降压药与内皮功能
内皮细胞(endothelial cell,EC)在维护血管张力和结构方面起重要作用.内皮功能障碍是高血压及其它大多数心血管危险因子的重要特征,是动脉血栓形成及心血管事件的主要始动及促发因素.研究表明,高血压与内皮功能密切相关,某些降压药可改善或恢复EC功能,减少心血管事件的发生.本文主要评价不同种类降压药对内皮功能的影响及其可能的机制.
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分选高纯度肾小球内皮细胞基础上应用小干扰RNA技术分析5-脂氧合酶激活蛋白的作用
目的:采用多个内皮细胞特异性表达或吸收的蛋白分选高纯度的肾小球内皮细胞,观察5-脂氧合酶激活蛋白在细胞因子诱导的肾小球内皮细胞蛋白通透性中的可能作用.方法:实验于2005-12/2007-03在卫生部北京老年医学研究所完成.①实验材料:雌性Wistar大鼠2只,100～120 g.②实验过程:用胶原酶消化大鼠肾小球细胞,先后用抗CD31和抗acetylated-LDL抗体标记细胞,通过流式细胞仪纯化肾小球内皮细胞,用抗CD54、CD106和CD62E鉴定分离的细胞.③评估:通过小干扰RNA技术抑制肾小球血管内皮细胞表达5-脂氧合酶;用干扰素-γ刺激细胞,通过免疫印迹杂交和免疫荧光组织化学检测5-脂氧合酶蛋白的表达;用FITC标记的BSA作为指示剂来测量体外培养的肾小球血管内皮细胞的蛋白通透性.结果:①分选高纯度肾小球内皮细胞:CD31磁珠分选得到83.3% CD31阳性细胞,其中12.5%为同时CD31+和高吸收acetylated-LDL.分离该双阳性细胞后得到纯度大于99.2%的肾小球内皮细胞.流式细胞仪检测显示这些细胞的CD54、CD106和CD6也均为阳性.在相差显微镜下观察,细胞形态呈鹅卵石状.②细胞膜上5-脂氧合酶定位:用干扰素-γ处理细胞后,5-脂氧合酶蛋白表达水平升高并呈时间和剂量依赖性.③细胞转染5-脂氧合酶小干扰RNA后结果:用干扰素-γ处理,干扰素-γ不能诱导5-脂氧合酶的高表达;用干扰素-γ处理细胞后转染5-脂氧合酶小干扰RNA,干扰素-γ诱导5-脂氧合酶蛋白表达水平被明显抑制.④在5-脂氧合酶小干扰RNA转染细胞中干扰素-γ处理和未处理细胞白蛋白的通透率:分别为(0.37±0.09)% 和(0.31±0.06)%,差异没有显著性(P＞0.05).结论:干扰素-γ能够诱导肾小球内皮细胞表达5-脂氧合酶蛋白并导致细胞通透性增高.5-脂氧合酶蛋白介导了干扰素-γ诱导细胞通透性增高的过程.
关键词： 5-脂氧合酶激活蛋白 内皮/细胞学 肾小球 组织构建 -
内皮抑素重组腺病毒表达载体构建及对内皮细胞增殖的影响
背景: 烧创伤后创面愈合多伴有瘢痕增生,内皮细胞在瘢痕增生中具有重要作用,抑制内皮细胞的生长可以在一定程度上减轻瘢痕增生.目的: 构建含有人内皮抑索基因的重组腺病毒Ad/hEnd,并观察与感染该病毒的角朊细胞共培养时内皮细胞增殖特性的改变.设计、时间及地点: 观察对照实验,于2006-09/2007-05在解放军第三军医大学西南医院烧伤研究所国家重点实验室完成.材料: pAdTrack-CMV及pAdEasy-1购自美国Stratagene公司:293细胞及大肠杆菌Ecoli.DH5 α由本室保存.方法: 以人胎肝组织mRNA为模板,通过反转录-聚合酶链反应及聚合酶链反应获得内皮抑素基因序列,插入到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,获得重组质粒pAdTrack-ES.经鉴定后将阳性重组子转化至pAdeasy1受体菌,筛选阳性克隆.脂质体介导转染293细胞,获取Ad/hEnd,经聚合酶链反应鉴定及上清中内皮抑素含量检测后,感染角朊细胞,采用套皿法与内皮细胞共培养.并与未转染的角朊细胞进行对照观察.主要观察指标: pAd/hEnd的同源重组及其鉴定,Ad/hEnd的产生与鉴定,转染293细胞后内皮抑素的表达,Ad/hEnd的纯化与滴度测定,培养液中内皮抑素含量,内皮细胞凋亡百分数及内皮细胞抑制率测定.结果: ①成功获取了Ad/hEnd,病毒滴度可达1.65×1012PFU/L.②感染Ad/hEnd的角朊细胞可有效表达并分泌内皮抑素,连续培养3 d后,培养液中内皮抑素含量可达226 μg/L.③与转基因角朊细胞共培养的内皮细胞凋亡百分数与细胞抑制率均显著高于对照组(P<0.05).结论: 与内皮细胞共培养时.转Ad/hEnd角朊细胞可通过分泌内皮抑素促进内皮细胞凋亡,并抑制其增殖.
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不同年龄大鼠大脑中动脉弹性纤维的变化
背景:大脑中动脉弹性纤维的变化与老年性脑血管疾病密切相关.目的:观察不同年龄大鼠大脑中动脉弹性纤维的变化.设计:以实验动物为观察对象的对比实验.单位:解放军第三军医大学解剖教研室和中心实验室.材料:健康Wistar大鼠36只,雌雄不拘,体质量200～280 g,由重庆第三军医大学动物所提供[生产合格证号:SCXX(军)2002-007].干预:运用光镜、电镜和图像分析仪对不同年龄的大鼠大脑中动脉弹性纤维进行系统研究.主要观察指标:①主要结局:各年龄大鼠大脑中动脉内弹性膜的变化.②次要结局:透射电镜下观察内弹性膜超微结构变化.结果:随着年龄增加,内弹性膜折叠的幅度和数量均减小,弹性纤维含量显著减少(P＜0.01),胶原纤维与弹性纤维的比值显著增加(P＜0.01);＞24月龄组内弹性膜变薄,不均质,内皮细胞和平滑肌细胞向内弹性膜穿过,内弹性膜内出现脂质,并有分层、断裂现象.结论:弹性纤维的变化可能与年老后易发生脑血管疾病有关.
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人脐血CD133+和CD133-细胞分化为内皮细胞的实验研究
目的:从人脐血中分离鉴定、培养和诱导分化人脐血CD133+细胞和CD133-细胞,建立一种能够方便获得高纯度人脐血CD133细胞的方法,同时在体外诱导该细胞向内皮细胞分化,进一步明确CD133+细胞与CD133-细胞之间的关系.方法:从新鲜脐血中纯化的CD133+和CD133-接种于添加了干细胞因子(stem cellfactor,SCF),IL-3,IL-6的Sigma无血清培养液中,检测CD133+细胞抗原标志,观察梭形贴壁细胞的出现时间和特异性细胞标志.结果:免疫磁珠法分离的CD133+细胞数为(6.08～6.80)×105,CD133+细胞的纯度(96.18±1.83)%.CD133-细胞(0.02±0.01)%.培养3～5 d可观察到梭形贴壁细胞,15d左右可形成索条状结构,贴壁细胞表达血管内皮细胞特异性标志血管内皮钙黏蛋白,血浆血管性假性血友病因子(von Willebrandfactor,vWF),UEA-1和血管内皮生长因子受体2(vascular endothelial growthfactor receptor-2,VEGFR-2).结论:采用先用密度梯度离心法离心后再用免疫磁珠分选的方法来分离CD133+细胞和CD133-细胞,分离到的细胞纯度高,在一定的条件下,可分化为内皮样细胞.
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丹参阻抑慢性肺源性心脏病肺血管内皮细胞损伤的效应与途径
目的:探讨丹参注射液治疗慢性肺源性心脏病(简称肺心病)时对肺血管内皮细胞损伤的保护作用,以及对血管内皮细胞分泌功能的影响.方法:选择1999-02/08吉林大学第四医院呼吸内科收治的慢性肺心病急性发作期患者44例.随机分为丹参组和对照组,各22例.对照组给予一般常规治疗,丹参组在一般常规治疗同时加用丹参注射液静脉滴注,50 g/L葡萄糖注射液250 mL中加丹参注射液20 mL,1次/d,连用14 d.两组治疗前后均采血测定静脉血循环内皮细胞、血浆内皮素-1.采用ABL-520型血液气体酸碱分析仪检测动脉血酸碱度、动脉血氧分压、动脉血二氧化碳分压.结果:纳入患者44例,均进入结果分析.①循环内皮细胞:丹参组治疗后较治疗前下降明显[(0.87±0.23),(1.27±0.26)×107 L,t=7.99,P=0.000];对照组治疗后较治疗前下降不明显[(1.09±0.28),(1.19±0.26)×107 L-1,t=2.00,P=.059];治疗后丹参组与对照组比较下降明显(t=4.03,P=0.000).②内皮素-1:丹参组治疗后较治疗前下降明显[(70±14),(105±26)ng/L,t=8.64,P=0.000];对照组治疗后较治疗前下降不明显[(88±23),(99±24)ng/L,t=2.00,P=0.059];治疗后丹参组与对照组比较下降明显(t=3.99,P=0.000).③直线相关分析:循环内皮细胞与内皮素-1呈显著正相关(r=0.733,P<0.01);与动脉血氧分压呈显著负相关(r=-0.751,P<0.01);而与动脉血酸碱度、动脉血二氧化碳无明显相关性(r=-0.115,0.237,P>0.05).结论:丹参对于慢性肺心病患者的肺血管内皮细胞具有保护作用,使其免受损伤和对抗内皮素-1,使内皮素-1合成减少,或同时使内皮素-1灭活增加,从而达到阻抑或减轻肺血管内皮细胞损伤而带来的一系列病理反应.
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自体移植静脉内皮细胞的缺血安全时限
目的:观察离体后不同缺血时间自体移植静脉内皮细胞的损伤程度,分析移植静脉内皮细胞缺血的安全时限.方法:实验于2005-07/2005-12在中国人民解放军胸心外科研究所完成.选择健康成年家犬29只,购自解放军第二军医大学实验动物中心.①不同缺血时间移植静脉内皮细胞损伤实验:按随机数字表法选取5只家犬,取双侧股静脉,按离体后0 min,30 min,60 min,90 min 4个时间点行扫描电镜及透射电镜检查,观察内皮细胞的损伤程度,Ⅰ级正常,Ⅱ级轻度,Ⅲ级中度,Ⅳ级重度,Ⅴ级坏死,将Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ级损伤归类为可逆性损伤;将Ⅳ,Ⅴ级损伤归类为不可逆损伤.②自体移植静脉内皮细胞缺血安全时限实验:将剩余24只家犬建立犬股静脉离体不同时间(30 min,60 min,90 min)的自体移植模型,在术后1 d,3 d,7 d,14 d再次手术取出静脉,行扫描电镜检查,比较不同时间点移植静脉内皮覆盖率.结果:①缺血0 min,30 min,60 min,90 min组(n=60)不可逆性损伤内皮细胞数分别为12,6,28,33,缺血60 min、90 min组内皮细胞的损伤程度明显重于缺血0 min和30 min组.各组的内皮细胞覆盖率比较差异无显著性意义(P＞0.05).②24只模型犬全部存活,切口愈合佳,无红肿、溢脓或裂开.③移植术后1 d,14 d,缺血30 min,60 min及90 min组内皮细胞覆盖率差异无显著性意义(P＞0.05),而术后3 d,7 d,缺血30 min组的内皮细胞覆盖率显著高于缺血60 min及90 mjn组[(62.21±3.52)%,(40.09±2.56)%,(36.17±4.55)%(P＜0.01);(82.31±3.76)%,(60.22±3.23)%,(59.39±4.27)%(P＜0.01)].结论:缺血60 min后静脉内皮细胞的超微结构会发生明显的不可逆性损害,移植静脉内皮细胞缺血的安全时限是60 min.
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肾脏移植物血管内皮细胞替代现象
目的:移植受者来源的内皮细胞出现在供者移植物中,替代原有的细胞,称为内皮替代,也称内皮嵌合.使用X,Y染色体探针通过荧光原位杂交法观察移植肾中血管内皮细胞被受体内皮细胞替代的情况,并分析内皮细胞替代的影响因素.方法:①收集解放军总医院第二附属医院病理科和北京大学医学部病理系1996-01/2005-12归档的移植肾穿刺活检符合男性供者、女性受者的石蜡包埋标本34例.②选择Y染色体长臂Yq12区域(异染色质区)DNA片段作为探针,同时选择X染色体着丝粒区(α卫星DNA探针作为对照,通过在石蜡切片标本上进行间期细胞双色荧光原位杂交法,观察移植肾穿刺活检标本的内皮替代现象,分析其与排斥反应及冷缺血时间的关系. 结果:①肾脏移植物中血管内皮细胞替代现象存在较为普遍,17例移植肾出现内皮细胞替代.②血管内皮细胞替代的发生与排斥反应无明显相关性(P > 0.05).③发生内皮细胞替代的移植肾冷缺血时间长于无替代移植肾(P < 0.05).结论:内皮细胞替代与排斥反应的发生无明显关系,移植肾冷缺血时间延长可促进血管内皮细胞替代的发生.
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肝再生过程中肝窦内皮细胞膜蛋白质组学研究的可行性探讨
学术背景:肝再生是关系到肝移植、肝切除的重要病理生理过程,部分肝切除术后肝再生过程涉及血管新生的证据已经得到证实.目的:回顾肝再生的研究背景,综合分析开展肝再生过程中肝窦内皮细胞膜蛋白质组学研究的可行性.检索策略:由熊力、李选文联机检索CHKD(www.chkd.cnkki.net)和PubMed(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/)数据库1994-01/2007-07有关肝再生过程中肝窦内皮细胞膜蛋白质组学方面的文献,关键词(中文或其他语言)为"肝再生;肝窦内皮细胞;亚细胞蛋白质组;膜蛋白;肝移植".获得相关中英文文献64篇,初筛后排除研究目与课题无关及内容重复的研究,保留39篇文献进一步分析.未发表的文献存档备用.文献评价:①文献来源情况:随机对照试验15篇,循证医学系统综述5篇,汇总分析14篇,经验交流5篇.②评价人:熊力.资料综合:有关肝再生的信号通路研究较多,目前认为存在两条通路,但蛋白质层面的机制尚待研究.肝窦内皮细胞是具有重要功能的非实质细胞,然而有关肝窦内皮细胞在肝再生中作用的研究较少,也未见关于肝再生过程中肝窦内皮细胞膜蛋白质组学的研究报道.结论:目前有关肝再生过程中肝窦内皮细胞膜蛋白质组学的研究报道极少.作者首次提出肝窦内皮细胞可能是肝再生瓶颈的假想,认为开展肝窦内皮细胞膜蛋白质组学的相关研究对于肝切除、肝移植具有重要意义.
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氧自由基对培养人脐静脉内皮细胞代谢产物的影响
目的:观察氧自由基对培养的人脐静脉内皮细胞产生的裂解不对称二甲精氨酸的酶一二甲精氨酸-二甲赖氨酸水解酶活性及表达的影响,以探要讨不对称二甲精氨酸代谢机制及卡托普利的作用.方法:实验于2003-05/2004-06在南昌大学医学分子中心进行.采用改良的Jaffe法培养人脐静脉内皮细胞,取生长良好的3～6代人脐静脉内皮细胞分为4组:①空白对照组:加DMEM培养液.②氧自由基0.01,0.1 mmol/L组:分别加入氧自由基0.01,0.1 mmol/L.③卡托普利组:同时加入氧自由基0.1 mmol/L及卡托普利(100mg/L)共孵.孵育24h后,检测上清液中一氧化氮、一氧化氮合酶活性、内皮细胞的代谢产物不对称二甲精氨酸浓度以及反应二甲精氨酸-二甲赖氨酸水解酶酶活性的L-瓜氨酸浓度,采用Western blotting测定细胞裂解液中二甲精氨酸-二甲赖氨酸水解酶的蛋白表达.结果:①二甲精氨酸浓度:氧自由基0.01,0.1 mmol/L组均高于空白对照组[(2.71±0.35),(4.78±0.67),(0.81±0.12)μmol/L,P＜0.05,0.01],卡托普利组低于氧自由基0.1 mmol/L组[(2:03±0.35)μmol/L,P＜0.01].②L-瓜氨酸浓度:氧自由基0.01,0.1 mml//L组均低于空白对照组(P＜0.05,0.01),卡托普利组高于氧自由基0.1 mmol/L组(P＜0.01).③一氧化氮浓度及一氧化氮合酶活性:氧自由基0.01,0.1 mmol/L组均低于空白对照组(P＜0.05,0.01),卡托普利组高于氧自由基0.1 mmol/L组(P＜0.01).④二甲精氨酸-二甲赖氨酸水解酶的蛋白表达:各组间无差异(P＞0.05).结论:氧自由基培养下,内皮损伤,不对称二甲精氨酸的增加与二甲精氨酸-二甲赖氨酸水解酶的活性减弱有关,与其蛋白的表达无关.而卡托普利则通过增加二甲精氨酸-二甲赖氨酸水解酶活性促进不对称二甲精氨酸代谢,使一氧化氮合酶活性增加,抑制氧自由基对内皮功能的损伤.
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搏动信号对人脐静脉内皮细胞一氧化氮合成酶表达的影响
目的:观察搏动信号对人脐静脉内皮细胞中反映内皮细胞活性的内皮型一氧化氮合酶mRNA表达的影响.方法:实验于2004-06/2005-03在湘雅二医院心胸外科生物材料研究室和上海生物工程有限公司进行.将取自剖宫产产妇自愿捐献的无菌脐带的人脐静脉内皮细胞培养、传代,传4代后分为两组:①搏动培养组:先静放6～8 h待细胞贴壁后,用自行设计的细胞搏动培养装置,进行搏动培养.搏动参数:搏动频率150次/min,搏出量0.3 mL/次,搏动产生的压力30/9mm Hg(1mm Hg=0.133kPa).②静态培养组:不进行搏动,其余条件同搏动培养组.每组每个时间点5个样本.用反转录-聚合酶链反应方法,分别在第1,2,4,6,9,12,15,18天检测两组的人脐静脉内皮细胞的内皮型一氧化氮合酶mRNA的表达水平(相对吸光度值).结果:人脐静脉内皮细胞的内皮型一氧化氮合酶mRNA表达:①培养第1,4天,静态培养组明显高于搏动培养组(1.0±0.55比1.10±0.35;1.17±0.23比1.42±0.44,P＜0.05).②培养第2天两组比较差异不显著(1.16±0.18比1.25±0.35,P＞0.05).③培养第6,9,12,15,18天,搏动培养组明显高于静态培养组(1.52±0.14比1.27±0.30;1.60±0.19比1.16±0.33;1.68±0.44比0.99±0.31;1.7±0.24比1.1±0.94;1.7±0.16比1.0±0.28,P＜0.05).结论:搏动信号能提高人脐静脉内皮细胞的内皮型一氧化氮合酶的表达.提示搏动信号在维持细胞发挥正常的生理功能方面起到重要的作用,能增强细胞的生物活性.
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重组人质粒pEGFP-人内皮一氧化氮合酶的构建
目的:构建含有增强绿色荧光蛋白报道基因的人内皮一氧化氮合酶重组质粒,为细胞转染提供实验依据.方法:实验于2005-05/10在首都医科大学宣武医院完成.用EcoRⅠ酶切pBluescriptⅡSK-人内皮一氧化氮合酶质粒,获得人内皮一氧化氮合酶基因,设计引物进行聚合酶链反应扩增.将人内皮一氧化氮合酶与pMD 18-T simple平滑载体连接后,行EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切,回收人内皮一氧化氮合酶,然后将其与经过酶切处理的含有增强绿色荧光蛋白报道基因的载体pEGFP-C1进行连接,形成8.4 kb的质粒,经EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切进行电泳筛选、鉴定和测序.结果:①目的基因片段人内皮一氧化氮合酶cDNA的获得:pBluescriptⅡSK-人内皮一氧化氮合酶质粒经EcoRⅠ酶切后,电泳可见3 kb及3.7 kb处各出现一条条带,与质粒图谱所示相符,证明质粒正确.加人上下游引物行聚合酶链反应扩增后,电泳可见3.7 kb处出现一条条带,证明人内皮一氧化氮合酶cDNA的获取成功.②人内皮一氧化氮合酶cDNA的酶切处理:人内皮一氧化氮合酶与pMD 18-T simple平滑载体连接后,EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切,电泳分析可见3.7 kb和2.7 kb处各出现一条条带,证明两者连接成功.③pEGFP-人内皮一氧化氮合酶质粒的筛选:载体pEGFP-C1与人内皮一氧化氮合酶cDNA的连接后,EcoRⅠ单酶切电泳可见8.4 kb处出现一条条带,再用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切,电泳可见4.7 kb和3.7 kb处各出现一条条带,证明连接正确.④pEGFP-人内皮一氧化氮合酶质粒的序列测定:序列测定结果与pEGFP-C1插入点序列及目的基因片段人内皮一氧化氮合酶cDNA两端序列对比相同,证明重组质粒构建成功.结论:pEGFP-人内皮一氧化氮合酶重组质粒的成功构建,可用于细胞转染,为人内皮一氧化氮合酶基因转移治疗在心血管疾病中的应用提供实验基础.
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内皮前体细胞移植对新血管形成的促进作用
目的:观察体外培养的内皮前体细胞自体移植后在缺血肢体新血管形成和改善血液灌注过程中的形态学变化及其作用.方法:①实验于2002-08/2003-04在解放军总医院心内科实验室完成.选用成年雄性新西兰白兔20只.随机将动物分为2组,分别为细胞移植组和对照组(肌肉注射磷酸盐缓冲液1 mL),各10只.实验2个时间点3,5周各5只.②细胞移植组兔抽取骨髓,分离单个核细胞,采用内皮细胞专用培养基(添加体积分数0.2胎牛血清,肝素1×104 U/L和青霉素1×105 U/L)体外培养扩增内皮前体细胞并给予鉴定.细胞移植组动物肌肉注射内皮前体细胞悬液,移植细胞数量为(7.4±1.7)×106,共注射5个点.③分别饲养3和5周后行激光多普勒灌注显像显示缺血肢体血液灌注情况;行腹主动脉造影计数右侧大腿自腹股沟韧带至膝关节的血流时间,以股骨中点的垂直线为标准,计数侧支血管数目;行组织学和免疫组织化学检测观察缺血肌肉组织标记细胞是否整合至血管壁内.④采用t检验比较计量资料间差异.结果:①内皮前体细胞贴壁后呈纺锤体形,原代细胞呈集落生长,生长速度较慢,传代以后分布较均匀,生长迅速.原代细胞培养时可见较多杂细胞存在,但传代2次以后细胞形态非常单一.I型荆豆凝集素、乙酰化低密度脂蛋白和抗Ⅷ因子相关抗原单克隆抗体鉴定均为阳性,细胞纯度达100%.②内皮前体细胞移植后3周,激光多普勒灌注显像检测显示细胞移植组缺血肢体血液灌注显著改善(t=5.96,P＜0.01),血管造影显示细胞移植组侧支血管生成增多(t=5.28,＜0.01),血流速度增快(t=-6.85,P＜0.01).细胞移植后5周,切开动物缺血肢体皮肤发现,细胞移植组皮肤、皮下组织和肌肉基本不形成粘连,而对照组粘连严重,此时激光多普勒灌注显像检测显示细胞移植组和对照组血液灌注检测无显著差别(P＞0.05),但造影检测显示细胞移植组侧支血管数目明显多于对照组,血流时间明显短于对照组(t=3.32,-4.62,P＜0.01).③组织学检测显示对照组缺血肢体存在肌肉坏死现象,同时有大量炎细胞浸润,而细胞移植组未见未见肌肉坏死和炎细胞浸润,细胞追踪显示大量标记的细胞整合至血管壁内形成内皮细胞.结论:①骨髓中的内皮前体细胞可以在体外大量扩增,从而达到满足自体移植的需要.②内皮前体细胞自体移植后可以参与新血管形成,进而形成侧支血管,有效改善缺血组织的血液灌注.
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人脑动静脉畸形血管内皮细胞体外培养及其相关因子表达的关系
目的:为获取较纯净的人脑动静脉畸形(cerebral arteriovenous malformation,AVM)血管内皮细胞,以探讨血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growthfactor,EGF)、Tie受体及血管生成素1(angiopoietin 1,Ang 1)和血管生成素2(angiopoietin 2,ng2)在cAVM病变进展中的作用,为cAVM的康复干预提供理论依据.方法:收集手术切除的完整cAVM新鲜标本18例(SpetzlerⅡ～Ⅲ级),其中以出血为首发症状者10例、癫痫4例、头痛3例、局限性神经功能障碍1例.组织块贴壁法对cAVM血管内皮细胞进行培养和形态学观察.采用免疫组化检测内皮细胞第八因子相关抗原(FⅧ-RA),EGF,Tie1,ie2,ng1,ng2阳性表达.结果:相差显微镜下,培养的活细胞具有单层"卵石样"排列的典型特征,Ⅷ-RA免疫阳性表达率超过95%,证实为血管内皮细胞.内皮细胞中VEGF,ie2和Ang2表达显著,而Tie1及Ang1的表达较弱.结论:cAVM内皮细胞可以获取和培养繁殖,可供研究血管新生和脑血管畸形发病机制的体外模型;VEGF,ie受体及Ang1和Ang2可能与cAVM的形成、扩展和破裂出血有关.
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脂肪干细胞体外分化为内皮细胞的可行性
目的:以内皮前体细胞为对照,探讨具有多向分化性能的脂肪干细胞的体外培养和分化为内皮细胞的可能性.方法:①实验于2003-10/2004-02在解放军总医院心内科实验室完成.选用雄性壮年和老年新西兰白兔各3只.②抽取兔髂骨骨髓,Percoll密度梯度离心后取单个核细胞,采用贴壁法以内皮细胞专用培养基(添加体积分数0.2胎牛血清,内皮细胞基本培养基2和辅助因子碱性成纤维细胞生长因子,氢化可的松,血管内皮生长因子,表皮生长因子,胰岛素样生长因子1,抗坏血酸,庆大霉素等)培养扩增内皮前体细胞.③取兔腹部皮下脂肪组织,胰蛋白酶消化提取脂肪干细胞,Iscove改良的Dulbecco培养基培养扩增,将第2代脂肪干细胞传代后,分为2份,分别用内皮细胞专用培养基和Iscove改良的Dulbecco培养基培养2～4周,观察细胞的变化.用乙酰化低密度脂蛋白,Ⅰ型荆豆凝集素和鼠抗Ⅷ因子相关抗原单克隆抗体鉴定,观察脂肪干细胞是否分化为内皮细胞.结果:①原代内皮前体细胞接种后48 h才能贴壁,生长非常缓慢,呈集落状生长,一般需要10 d左右才能形成较大的集落,达到传代的目的,传代细胞生长迅速.内皮前体细胞必须使用含有多种刺激因子的培养基才能生长.②脂肪干细胞培养无需刺激因子,原代细胞接种12 h后即开始贴壁,继而迅速进入对数生长期,无集落形成,原代和传代细胞均生长迅速.将脂肪干细胞采用内皮细胞专用培养基培养2周后,细胞形态未见明显变化,但与内皮前体细胞一样,大部分细胞采用乙酰化低密度脂蛋白,Ⅰ型荆豆凝集素和鼠抗Ⅷ因子相关抗原单克隆抗体检测均为阳性;培养3周后细胞的贴壁习性改变,几乎所用细胞均为阳性,而采用Iscove改良的Dulbecco培养基培养的脂肪干细胞采用上述检测均为阴性.③壮年兔骨髓中内皮前体细胞含量较高,培养后能保持旺盛的分裂能力;老年兔骨髓中内皮前体细胞含量明显减少,有的老年动物骨髓甚至难以培养出内皮前体细胞,而且培养时细胞容易老化,表现为细胞体积增大,形态呈扁平状或不规则,细胞浆增多而核变小.壮年兔和老年兔脂肪干细胞在生长速度和细胞形态方面没有明显差别.结论:①脂肪干细胞培养远比内皮前体细胞简单,它不需要多种细胞因子刺激即可生长.②脂肪干细胞在使用内皮细胞专用培养基诱导后可快速分化为内皮细胞.③脂肪组织中有大量的脂肪干细胞,其体外增长和分化能力受年龄影响较小,而骨髓中内皮前体细胞含量和扩增性能受年龄影响较大.
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H2O2诱导内皮细胞凋亡及其机制探讨
[目的]探讨过氧化氢(H2O2)所致内皮细胞功能损害中的作用及其机制.[方法]人脐静脉内皮细胞(HUVEC)培养后,分为对照组(A组),H2O2处理组(B组),H2O2和蛋白激酶C(PKC)抑制剂GF109203处理组(C组),H2O2和P38抑制剂Apigenin处理组(D组).H2O2处理细胞30 min后加入相应试剂作用24 h.MTT法测定细胞存活率,Ki-67染色检测HUVEC增殖活性,免疫荧光染色方法检测细胞凋亡,Western blotting 检测p53蛋白表达.[结果]①B组可诱导HUVEC功能损伤,使HUVEC的存活率降低、增殖活性降低、细胞凋亡增加,并使p53蛋白的表达上调;②C组可显著抑制H2O2诱导的HUVEC功能损伤和p53蛋白表达的上调;而D组不能抑制H2O2诱导的HUVEC功能损伤和p53蛋白表达的上调.[结论]p53在氧化应激所致内皮细胞功能损害中起重要作用;而这些作用与PKC信号转导通路有关.
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外周血内皮祖细胞分离和培养的试验研究
[目的]研究从正常健康人外周血中提取内皮祖细胞的细胞形态、成集落数量,细胞数量和活性.[方法]选择正常健康人20例, 用密度梯度离心法从外周血获取单个核细胞,将其接种在人纤维连接蛋白(fibronectin) 包被培养板, 用加入生长因子VEGF165和bFGF的1640培基培养细胞,7d后贴壁细胞进行细胞分析.流式细胞仪检测细胞表面抗原CD34和KDR;MTT比色法检测细胞的生长状态;并分析细胞形态和成集落的数量.[结果]体外培养的内皮祖细胞的数量明显增多,活性明显增强.[结论]成人外周血中提取的单个核细胞,在一定条件下可以培养成为内皮祖细胞.
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视网膜微血管内皮细胞培养及血管二维模型的建立
目的培养人视网膜微血管内皮细胞,建立人视网膜血管体外二维模型.方法人视网膜血管内皮细胞在纤维连接蛋白包被的细胞培养池内,以无血清人内皮细胞培养基培养,形成二维血管模型.用辣根过氧化酶检测其通透性.部分血管模型加入5 ng/ml的血管内皮生长因子培养,与无血管内皮生长因子培养形成的血管模型比较通透性的变化,观察血管内皮生长因子对血管通透性的影响.结果2～4 d左右内皮细胞亚融合形成网状血管样结构,6 d左右形成较完整的二维血管模型.血管内皮生长因子可增大血管的通透性,促进血管生成.结论用人内皮细胞培养基可成功培养人视网膜血管内皮细胞;利用细胞培养池和无血清人内皮细胞培养基培养,可建立标准的体外视网膜二维血管模型.
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17-β雌二醇对高糖环境中内皮细胞MT1-MMP mRNA表达变化及其凋亡的影响
目的:研究雌二醇(E2)对高糖(Glu,30 mmol/L)环境中内皮细胞系EVC-304的凋亡及其膜型基质金属蛋白酶-1(MT1-MMP)mRNA表达的影响.方法:用E2干预高糖环境中的ECV-304,用四唑盐比色试验(MTT)检测高糖和E2对ECV-304增殖的影响;用流式细胞术(flow cytometry,FCM)和细胞基因组DNA Ladder法检测高糖和E2干预后ECV-304凋亡;用半定量RT-PCR法检测高糖和E2干预后ECV-304 MT1-MMP mRNA表达.结果:高糖可以促进EVC-304凋亡(P＜0.01),也可以降低MT1-MMP的表达(P＜0.01);E2在浓度为0.01～0.10 mmol/L时,可以拮抗高糖的促凋亡效应(P＜0.01),也可恢复性上调MT1-MMP的表达(P＜0.05).E2的这种效应不随时间变化而变化(P＜0.05).结论:高糖对内皮细胞具有毒性作用,E2对内皮细胞具有保护作用;E2还可以上调高糖环境中内皮细胞MT1-MMP的表达.
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人骨髓内皮前体细胞的体外培养和生物学特性
目的:体外分离纯化人骨髓内皮前体干细胞,研究其基本生物学特性.方法:利用密度梯度离心法分离成人骨髓得到单个核细胞,再用内皮细胞条件培养基培养得到内皮前体干细胞,观察细胞生长特性,通过检测细胞血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2)、Ⅷ因子相关抗原抗体表达和透射电镜对培养细胞进行鉴定.结果:原代培养后细胞贴壁生长,7～10 d形成集落或融合呈卵石形,免疫组化荧光染色后结果显示VEGFR-2, Ⅷ/vWF 阳性,透射电镜显示细胞内具有特征性的W-P小体.结论:用密度梯度离心法和条件培养可以从骨髓得到高纯度内皮前体干细胞,该细胞具有与血管内皮细胞共同的特征,可以进一步分化为血管内皮细胞,是理想的组织工程种子细胞.
