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重组人质粒pEGFP-人内皮一氧化氮合酶的构建
目的:构建含有增强绿色荧光蛋白报道基因的人内皮一氧化氮合酶重组质粒,为细胞转染提供实验依据.方法:实验于2005-05/10在首都医科大学宣武医院完成.用EcoRⅠ酶切pBluescriptⅡSK-人内皮一氧化氮合酶质粒,获得人内皮一氧化氮合酶基因,设计引物进行聚合酶链反应扩增.将人内皮一氧化氮合酶与pMD 18-T simple平滑载体连接后,行EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切,回收人内皮一氧化氮合酶,然后将其与经过酶切处理的含有增强绿色荧光蛋白报道基因的载体pEGFP-C1进行连接,形成8.4 kb的质粒,经EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切进行电泳筛选、鉴定和测序.结果:①目的基因片段人内皮一氧化氮合酶cDNA的获得:pBluescriptⅡSK-人内皮一氧化氮合酶质粒经EcoRⅠ酶切后,电泳可见3 kb及3.7 kb处各出现一条条带,与质粒图谱所示相符,证明质粒正确.加人上下游引物行聚合酶链反应扩增后,电泳可见3.7 kb处出现一条条带,证明人内皮一氧化氮合酶cDNA的获取成功.②人内皮一氧化氮合酶cDNA的酶切处理:人内皮一氧化氮合酶与pMD 18-T simple平滑载体连接后,EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切,电泳分析可见3.7 kb和2.7 kb处各出现一条条带,证明两者连接成功.③pEGFP-人内皮一氧化氮合酶质粒的筛选:载体pEGFP-C1与人内皮一氧化氮合酶cDNA的连接后,EcoRⅠ单酶切电泳可见8.4 kb处出现一条条带,再用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切,电泳可见4.7 kb和3.7 kb处各出现一条条带,证明连接正确.④pEGFP-人内皮一氧化氮合酶质粒的序列测定:序列测定结果与pEGFP-C1插入点序列及目的基因片段人内皮一氧化氮合酶cDNA两端序列对比相同,证明重组质粒构建成功.结论:pEGFP-人内皮一氧化氮合酶重组质粒的成功构建,可用于细胞转染,为人内皮一氧化氮合酶基因转移治疗在心血管疾病中的应用提供实验基础.
