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荧光标记的嗜水气单胞菌溶素变异体试验在867例贫血患者PNH克隆筛查中的应用
目的 探讨荧光标记的嗜水气单胞菌溶素变异体(Flaer)试验对于贫血患者PNH克隆筛查的意义.方法 回顾性研究.收集2016年8月至2017年10月期间郑州大学第一附属医院门诊及住院贫血患者共867例,男388例,女479例,中位年龄47岁(8月～89岁).所有患者均接受流式细胞术检测中性粒细胞和单核细胞表面Flaer的表达及红细胞表面CD59的表达,672例患者进行了Ham试验.定量资料组间比较采用Mann-Whitney U秩和检验,配对资料组间比较采用Wilcoxon秩和检验及Mcnemar秩和检验.结果 867例贫血患者中,Flaer试验阳性者87例(10.03％),CD59试验阳性者43例(4.96％).PNH患者中,中性粒细胞[(73.94±28.59)％,(x±s)％]与单核细胞[(76.73±23.64)％]Flaer缺失率均高于CD59试验[(11.15±21.56)％]缺失率(Z=-6.764,P<0.001;Z=-6.618,P<0.001),而中性粒细胞Flaer缺失率与单核细胞Flaer缺失率无明显差异(Z=-0.085,P=0.933).Flaer试验阳性的87例患者中,PNH患者中性粒细胞及单核细胞Flaer缺失率[(76.32±25.74)％,(75.40±25.61)％]均高于非PNH患者[(14.00±24.10)％,(16.74±27.32)％](Z=-6.432,P<0.001;Z=-5.732,P<0.001).结论 Flaer试验用于贫血患者的PNH克隆筛查,对于PNH的诊断及鉴别诊断有重要意义.
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数字医学推动肝脏外科的进展
目前三维（three dimensional，3D）可视化、3D打印、3D腹腔镜、达芬奇机器人、分子荧光和光/声多模等数字医学新技术进展迅速，已在多个医学领域中得到广泛的应用[1]。本文就数字医学新技术在肝脏外科的应用进行简要阐述[2]。
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采用Calcein-AM评价白血病细胞膜P-gp泵功能及其逆转剂合理应用的研究
目的 通过荧光染料Calcein-AM(C-AM)在K562及其耐长春新碱(VCR)的细胞系K562/VCR细胞中的变化以及异搏定(VER)、环孢霉素A(CSA)对C-AM在K562和K562/VCR细胞中摄取与排出的影响,研究C-AM在评价P-gp泵功能的作用,评价两种逆转剂的逆转作用,为临床合理应用逆转剂提供实验依据.方法 以K562及K562/VCR为实验对象,以流式细胞术测定两种细胞系内不同时间点(0、30、60、90和120 min)的C-AM荧光强度来反映P-gp泵功能以及CSA、VER对其的影响.结果 C-AM在K562和K562/VCR细胞中的变化以24 h内为明显,24 h后K562细胞和K562/VCR细胞内C-AM荧光强度分别下降至14.57%和15.64%.其在K562细胞内各时间点的平均荧光强度(MFI)明显高于K562/VCR细胞(各时间点差异P值均＜0.05);CSA、VER和CSA+VER对K562细胞内C-AM的摄取和外排无明显影响,但各组逆转剂、C-AM与细胞共孵育120 min后,对照组、CSA、VER和CSA+VER组的K562/VCR细胞MFI分别为3251±106.7、4014±219.0、3879±116.1和4158±302.6,与对照组相比,后三组细胞对CAM的摄取明显增加(P均＜0.05).当外排120 min后,对照组、CSA、VER和CSA+VER组的K562/VCR细胞MFI分别为1622±191.0、2237±155.2、1932±233.0和2231±146.7,与对照组相比,后三组的CAM残余量也明显增加(P均＜0.05),表明CSA、VER和CSA+VER能增加K562/VCR细胞对C-AM的摄取和减少细胞内C-AM的外排.结论 P-gp的表达能减少K562/VCR细胞对C-AM的摄取和增加其对C-AM外排,逆转剂CSA与VER的联合应用对K562/VCR细胞摄取和外排C-AM的影响并不比单独使用CSA或VER明显,通过使用C-AM和流式细胞术,可以比较迅速、简便评价白血病细胞P-gp的泵功能以及逆转剂的逆转作用.
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NGAL基因3'端序列转录调控元件的克隆与鉴定
目的:将不同长度的NGAL基因3'端序列(包括外显子、内含子和部分3'侧翼非翻译序列)克隆到pGL3-Promoter(pGLP)载体中,通过检测报告基因荧光素酶活力,确认NGAL 3'端序列中是否含有增强子或抑制子元件.方法:应用PCR技术从SHEEC细胞基因组DNA中扩增出不同长度的NGAL基因片段F5(1 880 bp)和F7(826 bp),将其克隆到pGEM-T easy载体,并测序验证;再亚克隆到pGL3-Promoter载体中,获得pGLP-F5和pGLP-F7表达载体;将pGLP-F5和pGLP-F7载体分别与pRL-TK载体共转染HeLa、EC109和Vero细胞,通过检测相对荧光素酶活力,确认这些NGAL基因片段中是否含有增强子元件.结果:我们成功构建了pGLP-F5和pGLP-F7重组载体.Hela、EC109和Vero转染细胞与pGL3-Promoter相比,酶活力未表现出明显的增强或减弱.结论:在本研究的实验条件下,NGAL基因F5和F7片段内潜在的顺式作用元件并没有发挥作用,或作用不明显.
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脊髓室管膜瘤患者术中黄荧光技术的应用
目的 探讨脊髓室管膜瘤患者术中黄荧光技术的应用.方法 回顾性分析清华大学附属北京清华长庚医院神经外科2014年12月至2015年12月术中应用黄荧光显影技术确定肿瘤边界的脊髓室管膜瘤患者的临床资料,共56例.于麻醉前30 min静脉内注射荧光素钠(3～4 mg/kg),在传统白光模式和黄荧光模式下交替显影并切除肿瘤.术后3个月观察肿瘤的切除情况及脊髓功能障碍改善情况,行McCormick脊髓功能分级评估.结果 56例患者中,肿瘤全切除率为100.0％.其中肿瘤荧光显影明显者47例(术前均为MRI增强),在荧光模式辅助下切除肿瘤;荧光不显影或显影不明显者9例(2例术前MRI增强不明显;7例发生肿瘤卒中,MRI增强不均匀),在白光模式下切除肿瘤.与术后7d及1个月比较,术后3个月感觉、运动功能改善率分别为83.0％ (44/53)和82.4％(42/51),差异均有统计学意义(均P＜0.01);尿、便改善比例为8/12,差异无统计学意义(P＞0.05).56例中,术后3个月McCormick脊髓功能评级Ⅰ～Ⅳ级者分别占57.2％(32例)、21.4％(12例)、14.3％(8例)、7.1％(4例),与术前的3.6％(2例)、55.3％(31例)、25.0％(14例)、16.1％(9例)比较,差异有统计学意义(P＜0.01),其中Ⅰ、Ⅱ级者疗效好,Ⅲ、Ⅳ级者疗效差.术后3个月MRI检查未见肿瘤残留和复发.结论 脊髓室管膜瘤术中辅助黄荧光技术有助于全切除肿瘤.
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荧光素酶光成像实时监测诱导凋亡配体基因治疗裸鼠肺癌A549细胞移植瘤的实验研究
目的 应用人肿瘤坏死因子相关的诱导凋亡配体( hTRAIL)基因和萤火虫荧光素酶(luc)基因的腺病毒双表达载体(ad-hTRAIL-luc),以luc为报告基因,活体内监测hTRAIL基因的表达及作用.方法 皮下接种法建立肺癌A549细胞裸鼠移植瘤模型,瘤内多点注射腺病毒载体ad-luc-hTRAIL、ad-hTRAIL、ad-luc.对照组注射磷酸盐缓冲液(PBS).于注射后4、7、10、14、21、28 d动态测量各组肿瘤大小,并利用高敏感、超低温(CCD)照相机进行活体生物发光成像检测luc活性,然后处死动物,免疫组织化学(简称免疫组化)法检测各组hTRAIL蛋白表达情况,并进行免疫组化评分(IHS)；TUNEL法检测各组肿瘤细胞凋亡情况,并计算凋亡率.统计分析组间比较采用方差分析,两样本比较采用配对t检验.对ad-luc-hTRAIL组的发光光子数、免疫组化评分、凋亡率3种结果进行线性相关分析.结果 ad-luc-hTRAIL与ad-hTRAIL组肿瘤生长速度明显较PBS组缓慢(t=2.71、2.72,P＜0.05),28 d后各组肿瘤体积分别为(208.4 ±42.3)、(181.5 ±23.9)、(427.0±59.3)mm3,ad-luc组与PBS组肿瘤生长差异无统计学意义(t=2.07,P＞0.05).ad-luc-hTRAIL组luc活性于治疗后第7天达高峰(1.37±1.04)后快速下降.ad-luc-hTRAIL与ad-hTRAIL 2组在注射载体后第7天hTRAIL表达及肿瘤细胞凋亡率达高峰,IHS峰值分别为6.25 ±2.06和6.5 ±2.89,肿瘤细胞凋亡率峰值分别为(60.75±8.06)％和(61.50±8.47)％.ad-luc-hTRAIL组luc表达量(绝对光子数)与IHS、肿瘤细胞凋亡率三者间均呈线性正相关(r光子数/IHs=0.942,r光子数/凋亡率=0.842,rIHs/凋亡率=0.887,P值均＜0.05).结论 目的基因可以有效地通过ad-luc-hTRAIL转导入裸鼠肺癌A549细胞移植瘤内并高水平表达,发挥生长抑制和促凋亡作用,体外CCD照相机观察luc的表达可实时监测hTRAIL基因的表达,反映hTRAIL基因治疗肿瘤的疗效.
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构建创伤修复相关基因p21表达载体
目的:构建创伤修复相关基因p21启动子驱动的荧光素酶报告基因表达载体,并评估其稳定性和可靠性.方法:实验于2004-06/08在第三军医大学西南医院烧伤研究所内皮细胞室完成.野生型p21基因启动子全序列经酶切亚克隆入pGL3-basic荧光素酶报告基因载体,重组载体pGL3-p21p转染ECV304细胞,并应用双荧光素酶检测系统检测荧光素酶活性,排除转染过程误差.结果:①目的片段克隆载体与p21基因启动子cDNA序列高度同源.②转染重组载体pGL3-p21p和E47+IPTG诱导细胞荧光素酶活性明显增强,而空载体pGL3-basic的荧光素酶表达处于基础水平,两者比较差异有显著性意义(P＜0.05).结论:构建的野生型p21基因启动子驱动的荧光素酶报告基因载体,转染ECV304细胞后能够表达荧光素酶蛋白,具有稳定和可靠性能.
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激光共聚焦扫描显微镜动态观察体外培养大鼠皮层神经元受氯化亚铁作用时过氧化物水平及膜电位的变化
目的:建立外伤性癫痫的铁离子诱导细胞模型,观察N-乙酰半胱氨酸及德巴金预处理对受氯化亚铁作用的皮层神经元过氧化物及膜电位的影响.方法:实验于2004-10/2005-06在南方医科大学珠江医院神经外科实验室完成.①培养的新生SD大鼠神经元细胞,随机分为5组:对照组,模型组(1 mmol/L),N-乙酰半胱氨酸预处理组(终浓度0.08g/L);丙戊酸钠(德巴金)预处理组(终浓度0.1g/L);N-乙酰半胱氨酸+德巴金预处理组(终浓度分别为0.08g/L及0.1g/L).②采用荧光探剂DiBAC4(3)和乙酰乙酸盐2',7'二氯氢化荧光素分别标记,激光共聚焦扫描显微镜(LCSM)断层光切扫描动态观察体外培养的大鼠脑皮层神经元受氯化亚铁作用时的细胞膜电位和过氧化物水平变化.③免疫组织化学检测核因子-κB的表达情况.结果:①大鼠脑皮层神经元过氧化物水平:与对照组比较,模型组过氧化物的相对荧光强度值著性增高(3.39±121,18.95±16.26,P=0.038＜0.05);N-乙酰半胱氨酸预处理组及N-乙酰半胱氨酸+德巴金预处理组相对荧光强度变化呈负值(-19.66±10.40,-14.84±5.08),与模型组比较差异有显著性(P＜0.01);德巴金预处理组(22.89±0.91)相对荧光强度变化与模型组比较,差异无显著性意义(P＞0.05).②各组细胞膜电位测定结果:德巴金预处理组及N-乙酰半胱氨酸+德巴金预处理组相对荧光强度值明显低于模型组(-11.18±3.12,4.45±1.69,25.15±8.84,P＜0.01);而N-乙酰半胱氨酸预处理组相对荧光强度变化(23.13±18.92)与模型组差异无显著性意义(P＞0.05).③模型组较对照组核因子κB染色强度明显增加;N-乙酰半胱氨酸预处理组与N-乙酰半胱氨酸+德巴金预处理组较模型组染色强度明显降低.结论:氯化亚铁对皮层神经元的作用可导致过氧化物的生成,导致膜电位的改变,N-乙酰半胱氨酸预保护可减少其过氧化物等自由基的生成,德巴金可起到稳定皮层神经元膜电位的作用,两者共同预处理可显著减轻皮层神经元受氯化亚铁作用的损伤.抗氧化剂联合抗癫痫药可能有助于防治与铁剂诱发有关的癫痫发作.
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共聚焦激光显微内镜对溃疡性结肠炎肠黏膜修复的病理改变评估
目的 评价共聚焦激光显微内镜(CLE)在评判溃疡性结肠炎(UC)黏膜功能修复状态的优势作用.方法 2014年7月至2016年12月间于浙江大学医学院附属第一医院确诊并治疗后复查的30例UC患者为研究组,选取同期行肠镜检查发现结肠息肉并拟行结肠息肉切除术的10例患者为对照组.两组患者均分别进行白光内镜及CLE检查,之后进行荧光素渗出情况分析.结果 研究组中有10例患者白光内镜下全结肠段黏膜正常,另20例存在部分肠段黏膜异常,对照组全结肠段黏膜白光内镜下均显示正常.研究组白光内镜正常患者与对照组患者CLE下结肠荧光素钠渗出评分比较差异有统计学意义(P<0.05).研究组20例活动期UC患者中,白光内镜异常肠段与正常肠段CLE下荧光素钠渗出评分比较差异有统计学意义(P<0.05).Spearman相关性分析显示,研究组白光内镜下黏膜正常患者左半结肠黏膜CLE下荧光素钠渗出评分与活检组织病理组织学分级指数非等级相关(rs=0.394,P>0.05).结论 通过CLE可发现UC患者黏膜愈合过程中首先为结构修复,白光内镜下黏膜愈合并不能代表功能修复.CLE评估黏膜屏障功能改变优于组织活检病理检查.
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5-羧基荧光素标记葡聚糖Fe3 O4超顺磁性纳米颗粒的制备及性能检测
目的 构建5-FAM标记的葡聚糖(dextran)Fe3O4超顺磁性纳米颗粒,检测其物理和磁学性质、细胞毒性,并观察其在磁场下标记细胞的能力.方法 在超声波乳化作用下,用化学共沉淀法制备5-FAM-dextran-Fe3 O4纳米颗粒;用透射电镜和粒度分析仪观察微粒形态和大小;红外分析仪检测微粒表面结合的功能团;分光仪观察微粒的光学显像能力;振动样品磁强计检测微粒的磁响应性;MTT法检测5-FAM-dextran-Fe3 O4、dextran-Fe3 O4和Fe3 O4微粒对神经元细胞的生物毒性;共聚焦显微镜观察将荧光纳米颗粒与细胞共同孵育并给予不同外加磁场后,纳米颗粒标记神经元细胞的面积.采用单因素方差分析处理数据.结果 制得的5-FAM-dextran-Fe3 O4纳米颗粒均匀一致,直径为15~25 nm,平均粒径22 nm;其比饱和磁化强度、比剩余磁化强度、矫顽力(矫顽磁场强度)分别为86.02 A·m2·kg-1、15.05 A·m2·kg-1、5414.01 A/m,表现为超顺磁性;红外分析仪示Fe3 O4被dex-tran包裹并与5-FAM形成复合粒子;分光仪示纳米颗粒在紫外光下呈均一绿色荧光;MTT结果提示5-FAM-dextran-Fe3O4无明显细胞毒性;共聚焦显微镜下,500 mT磁场组细胞标记面积大[(0.880±0.046)mm2;F=320.298,P<0.05].结论 制备的5-FAM-dextran-Fe3 O4纳米颗粒可作为新型荧光-磁载体或探针应用于多种实验和临床研究.
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一种基于荧光图像的体外抗肿瘤药物快速筛选方法
目的:建立一种基于荧光成像的抗肿瘤药物体外快速筛选系统.方法:①采用二乙酸荧光素(FDA)标记测定活细胞数法,评价26个乌药组分对的体外抗肿瘤活性,并对本方法的线性范围和精密度进行了考察；②在活性筛选结果的指导下,应用LC/MS对样品进行分析,初步推断药效活性物质.结果:①该方法在细胞密度为0～ 10 000/孔的范围内荧光强度与细胞个数线性相关(r2 =0.9858),板内的精密度为9.41％；②在26个乌药组分中,筛选得到两个抗肿瘤活性较强的组分C13和C15,抑制率均达到90％以上.结论:本方法快速、稳定、简便、线性范围宽,可用于从复杂中药组分中快速筛选抗肿瘤活性物质.此外,根据LC/MS分析结果并结合文献报道,推断乌药中具有抗肿瘤活性的化合物为异波尔定碱.
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木香肝毒性组分筛查与GC-MS分析研究
目的:筛查中药材木香中潜在的肝毒性组分.方法:对木香25个化学组分,采用二乙酸荧光素荧光标记法在HepG2细胞模型上筛查肝毒性组分,并使用气相色谱-质谱联用仪分析其化学组成.结果:从木香中筛查出10个肝毒性组分,经气相色谱-质谱联用定性分析,C09组分的主要成分为去氢木香内酯、santamarine(或magnolialide)和reynosin,而C11组分的主要成分是α-木香醇和榄香醇.结论:木香所含的去氢木香内酯、santamarine(或magnolialide)、reynosin、α-木香醇和榄香醇可能具有肝毒性.
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苯基荧光酮-溴代16烷基三甲胺-锡体系测定罐头食品中的锡
随着罐头食品加工生产业的发展,人们进入罐头食品的数量增多,致使锡摄入量大为增加(人均1～38mg/d)[1].作者运用苯基荧光酮-溴代16烷基三甲胺(CTAB)-锡体系技术测定罐头食品中的锡,结果令人满意.现报告如下.
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前列腺特异抗原(PSA)启动子组织特异性鉴定
目的构建前列腺特异的PGL3-LUC表达载体,观察报告基因的表达情况以验证其组织特异性.方法经过改造的高效前列腺特异抗原(PSA)启动子全序列经酶切亚克隆入pGL3-basic荧光素酶报告基因载体,重组载体pGL3-psa转染前列腺癌细胞(Du-145)和肠癌细胞(HT-29),并应用双荧光素酶检测系统检测荧光素酶活性,排除转染过程误差.结果转染重组载体pGL3-psa诱导前列腺癌细胞荧光素酶活性明显增强,而空载体pGL3-basic和肠癌细胞的荧光素酶表达处于基础水平,比较差异有显著性意义P＜0.05.结论构建的经过改造的高效前列腺特异抗原(PSA)启动子的荧光素酶报告基因载体,转染前列腺癌细胞后能够表达荧光素酶蛋白,具有组织特异性.
关键词： 前列腺特异抗原(PSA) 转染 荧光素类 -
稳定表达荧光素酶裸鼠垂体腺瘤移植瘤模型的建立
目的 建立稳定表达荧光素酶的裸鼠垂体腺瘤移植瘤模型,并通过活体生物发光成像系统实时观察移植瘤的生长特点.方法 经G418药物选择性对转染细胞进行筛选,获得稳定表达荧光素酶的GH3-1uc和MMQ-1uc细胞系.将两株细胞系分别皮下接种于BALB/c裸鼠,建立BALB/c裸鼠移植瘤模型,利用活体生物发光成像系统观察肿瘤的成瘤和生长情况.结果 本组成功构建稳定表达荧光素酶的裸鼠GH3 - 1uc和MMQ-1uc移植瘤模型.体表直尺测量显示:移植瘤在接种MMQ-1uc和GH3-1uc细胞后10d内生长均较缓慢,15～30d肿瘤体积迅速增长,且MMQ-1uc移植瘤较GH3-1uc移植瘤生长快.活体生物发光成像系统荧光测量显示:接种GH3-1uc细胞移植瘤20 d时的荧光强度明显高于10d的荧光强度.活体生物发光成像系统荧光测量与取瘤直尺测量的肿瘤体积变化趋于一致,而体表直尺测量的肿瘤体积偏小.结论 稳定表达荧光素酶的裸鼠垂体腺瘤移植瘤模型的成功建立,不仅可用于活体生物发光成像系统实时观察肿瘤的成瘤及生长情况,而且为垂体腺瘤的研究及药物开发提供了方便、有效的平台.
