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缺氧诱导因子-1α反义寡核苷酸对缺氧时视网膜血管内皮细胞增殖活性影响的研究
目的 研究缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)反义寡核苷酸(ASODN)对缺氧时体外培养的牛眼视网膜血管内皮细胞(BREC)增殖活性的影响,探讨HIF-1αASODN 治疗视网膜新生血管性疾病的可行性.方法 根据Genbank 提供的HIF-1αcDNA 序列设计HIF-1αASODN,全硫代修饰,并用脂质体包被,体外转染BREC 细胞,荧光显微镜下计算转染效率.采用免疫组织化学法检测HIF-1α的表达,采用免疫组织化学法和生物荧光法分别检测细胞增殖细胞核抗原(PCNA)的表达、细胞内ATP 含量以分析细胞增殖能力.结果 荧光显微镜检测表明,HIF-1αASODN 可成功转染BREC.免疫荧光检测显示,未转染组缺氧开始时HIF-1α有极低表达,在缺氧1 h 时表达量显著上升,4 h 达到高峰,16 h 后下降.而ASODN 转染组HIF-1α的表达始终在极低水平,两组间差异有统计学意义(P ＜0.01).PCNA 免疫组织化学检测和细胞内ATP 含量测定结果显示,在缺氧后各检测点ASODN 转染组较对照组细胞增殖活性受到抑制,抑制作用在缺氧后8 h 为明显(P ＜0.01).结论 HIF-1αASODN 转染能有效抑制BREC 细胞HIF-1α的表达,从而降低细胞增殖活性,可能对视网膜新生血管性疾病有治疗作用.
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早产儿视网膜血管化的特点
目的：研究早产儿视网膜血管化的特点。方法对2009年9月1日至2010年8月31日在广东省妇幼保健院出生或收治的出生体重<2000 g的早产儿进行眼底筛查和随访。记录研究对象不同纠正胎龄时视网膜的血管化情况。采用Spearman相关分析进行数据处理。结果共入选新生儿231例，完成随访212例，随访率91.8%。其中早产儿视网膜病28例，发生率为13.2%；视网膜完全血管化184例。完成随访者的出生体重[中位数（小值~大值）]为1600 g（1000~1900 g），出生胎龄为32.4周（27.0~36.5周）。早产儿视网膜由Ⅰ、Ⅱ至和Ⅲ区先后完成血管化。随着纠正胎龄的增加，各区视网膜血管化率逐渐增加。在纠正胎龄32~周组中，Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ区视网膜完全血管化比例分别为87.1%（81/93）、7.5%（7/93）和0.0%（0/93）；纠正胎龄36周后，Ⅰ区视网膜全部完全血管化，Ⅱ和Ⅲ区视网膜完全血管化比例分别在纠正胎龄38周、40周明显增加，纠正胎龄达43周时，Ⅲ区视网膜完全血管化比例为100.0%（24/24）。Spearman相关分析发现，早产儿Ⅱ、Ⅲ区视网膜完全血管化进程与纠正胎龄呈正相关（r值分别为0.690和0.720，P值均为0.000）。早产儿纠正胎龄36周后Ⅰ区视网膜全部血管化，Ⅱ区视网膜完全血管化时的纠正胎龄为38.0周（32.2~40.4周），Ⅲ区视网膜完全血管化时的纠正胎龄为41.0周（36.0~42.6周）。早产儿生后Ⅱ、Ⅲ区视网膜由未完全血管化至完全血管化需2~3周；不同个体生后Ⅱ、Ⅲ区视网膜处于未完全血管化时，纠正胎龄相差约8~10周，Ⅱ、Ⅲ区视网膜完全血管化时，纠正胎龄分别相差约8周和6周。结论早产儿视网膜完全血管化进程个体差异较大。几乎所有早产儿在纠正胎龄达足月以后视网膜才完全血管化，大多数患儿需要随访至纠正胎龄41周。建议对不同纠正胎龄时期的早产儿侧重不同分区的眼底检查。
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代谢性酸中毒诱导新生大鼠视网膜新生血管缺氧诱导因子-lα的表达及其意义
目的 探讨缺氧诱导因子-lα(hypoxia-inducible factor-lα,HIF-lα)在代谢性酸中毒诱导视网膜新生血管中的表达和意义.方法 将120只新生SD大鼠随机分为酸中毒模型组和正常对照组,各60只.酸中毒模型组出生后第2天开始按535 mg/(kg·d)的剂量管饲氯化铵溶液 (质量浓度为50 mg/ml),2次/d,连续6 d,停药进入恢复期.2组大鼠分别于出生后第3、5、8、10、13、20天处死.二磷酸腺苷酶组织化学染色法观察新生大鼠视网膜血管的形态改变;HE染色观察视网膜血管增生情况,判断建模成功与否;免疫组织化学方法检测视网膜HIF-1α蛋白的表达变化.结果 二磷酸腺苷酶组织化学染色法显示酸中毒模型组大鼠10日龄可见视网膜大量新生血管异常形成,周边可见大片无灌注区.HE染色可见酸中毒模型组新生大鼠10日龄视网膜突破内界膜血管内皮细胞核显著多于同龄对照组,分别为(28.78±7.53)个与(1.22±1.48)个,差异有统计学意义(t=11.169,P<0.01).免疫组织化学结果显示,酸中毒模型组新生大鼠8、10、13日龄时视网膜HIF-1α的表达强度分别为108.87±15.21、183.68±26.58和129.42±9.85,明显高于同龄对照组,分别为74.98±4.50、76.38±3.38和74.78±1.86,差异均有统计学意义(t=4.625、9.023和9.672,P均<0.05).结论 HIF-1α在酸中毒诱导视网膜新生血管的发生、发展过程中可能发挥重要作用.
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高氧诱导新生鼠视网膜病变的实验研究
目的建立早产儿视网膜病(retinopathy of prematurity,ROP)的动物模型,为研究发病机制及治疗提供实验基础.方法选择7日龄新生小鼠54只,分为实验组和对照组.实验组27只,在氧浓度为75%的密闭容器中生长5 d,然后回到正常空气中;对照组27只,吸室内空气.观察两组视网膜病变,视网膜铺片经ADP酶染色,以了解视网膜血管的改变;视网膜切片经常规HE染色,计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数目,以定量反映视网膜血管的增生情况.结果实验组新生鼠在高氧中生长5 d后,视网膜血管明显收缩、阻塞,视网膜大片区域无灌注;回到正常空气中2 d后,新生血管开始形成;回到空气中5 d后(生后第17天),新生血管形成达到高峰.实验组小鼠生后第17天时突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数目达44个,而对照组不足2个,差异有非常显著性(P＜0.0001).结论该动物模型视网膜病变与早产儿视网膜病变相似,制备过程简便,可重复性高,并可进行定量研究,是研究ROP发病机制及治疗对策较合适的模型.
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色素上皮衍生因子对新生小鼠视网膜病变新生血管的抑制作用
目的 探讨色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor,PEDF)对高氧诱导的新生小鼠视网膜病变新生血管的抑制作用.方法 选取7日龄C57BL/6J新生小鼠吸75%高氧5 d后返回空气制备早产儿视网膜病(retinopathy of prematunty,ROP)的小鼠模型.通过对模型组(n=26)和模型对照组(n=26)小鼠视网膜比较,观察吸氧对视网膜血管的影响.治疗组(n=112):采用不同剂量和注药次数给ROP小鼠右眼玻璃体内注入PEDF,左眼作为自身对照,在生后17 d各组取材做视网膜铺片和切片,对视网膜新生血管进行形态学观察和定量研究.结果 ROP小鼠在生后第12天和14天右眼注入两次PEDF后,第17天时计数突破视网膜内界膜的细胞核数,1μg组左右眼细胞核数分别是(39.43±3.28)个和(13.51±2.05)个(P=0.000);2μg组左右眼细胞核数分别是(48.40±6.24)个和(11.80±1.74)个(P=0.000).血管形态和定量结果均显示眼内注射PEDF后新生血管形成明显减少.以2μg作为注射PEDF剂量,单次注药无效,二次和三次眼内注药有效果.结论 玻璃体内注入PEDF能有效抑制视网膜新生血管的生长,同时不影响正常血管的发育,可能成为防治ROP有效的血管抑制因子.
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早产儿视网膜血管发育成熟度的研究
目的 研究早产儿出生时视网膜血管的发育及其影响因素,与早产儿视网膜病(ROP)发生之间的关系.方法 2006年10至12月,在北京军区总医院新生儿监护病区住院的不同胎龄和出生体重的84例新生儿,于生后1周内,扩瞳后用Retcam Ⅱ数码照相机拍摄眼底照片,评价视网膜血管化的程度,分析母亲和婴儿因素对视网膜血管化的影响.并追踪观察视网膜血管化程度与ROP发生的关系.计数资料用四格表X2检验,计量资料以x±s表示,两样本均数行t检验.结果在本组84例中,视网膜血管化达到Ⅰ区和Ⅱ区在胎龄<30周早产儿组中为91.7%(11/12),在胎龄31～33周组为46.2%(12/26),在胎龄34～36周组为3.84%(1/26),在胎龄37～40周组为0(0/20);在出生体重<1500 g组为80%(12/15),1500 g<出生体重<1700 g组为57.1%(8/14),1700 g<出生体重<2000 g组为36.4%(4/11),在2000 g组为0(0/44).单变量分析显示胎龄(F=31.9193,P=0.000)、出生体重(F=32.4532,P=0.000)、产前使用糖皮质激素(F=36.9391,P=0.000)、表面活性物质(F=24.000,P=0.0000)、母亲营养状态(F=4.184,P=0.041)、RDS(F=17.6191,P=0.000)、生产方式(F=10.972,P=0.0022)和需氧超过48 h(F=22.076,P=0.0000)等和视网膜的不成熟有关.多变量分析显示视网膜血管化主要受胎龄(95%CI=1.57～261.728,P=0.021)影响.追踪观察视网膜不成熟的24例早产儿,终发现有15例发生ROP,占62.5%(X2=45.1087,P=0.000).结论在胎龄31～34周的早产儿视网膜血管化存在较大的变异性.母亲和胎儿因素可能影响出生时视网膜的血管范围.胎龄是影响视网膜成熟度的主要因素.不成熟的视网膜是发生ROP的根本原因.
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间充质干细胞在眼部新生血管性疾病治疗中的研究进展
眼部新生血管与多种眼部疾病相关,是引起视力严重损害的常见原因之一,其治疗一直是眼科界的难题.间充质干细胞具有易获得、易扩增、多向分化潜能、免疫原性低和伦理学争议较少等特点,使其在干细胞生物学领域中备受瞩目,而基于间充质干细胞的治疗策略,更为眼部新生血管性疾病的治疗带来新的契机.
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内皮祖细胞与视网膜新生血管
视网膜新生血管可见于多种眼部疾病,是引起视力损害的重要原因之一.新近研究发现,循环中的血管内皮祖细胞在视网膜新生血管的形成中起重要作用,并影响新生血管的严重程度.这一发现为视网膜新生血管的防治提供了新思路.针对血管内皮祖细胞的动员、趋化和黏附等治疗视网膜新生血管的方法正在探索中.
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两种检测小鼠氧诱导视网膜新生血管方法的比较
目的 比较异凝集素视网膜铺片染色和硫氰酸葡聚糖荧光素心脏灌注视网膜铺片两种方法检测氧诱导视网膜病变(0IR)新生血管的优缺点,探讨视网膜新生血管染色方法的合理选择.设计实验研究.研究对象C57BL/6J乳鼠OIR模型8只,正常对照8只.方法 OIR组和正常对照组各4只鼠视网膜铺片异凝集素染色,各4只鼠硫氰酸葡聚糖荧光素心脏灌注视网膜铺片.3位观察者盲法利用图像分析软件计算视网膜铺片上视网膜血管无灌注区和新生血管面积.主要指标不同观察者计算的视网膜新生血管及无灌注区面积的一致性(α值).结果 异凝集素染色视网膜铺片上,不同观察者计算的视网膜新生血管及无灌注区面积α值分别为0.858、0.959;硫氰酸葡聚糖荧光素心脏灌注视网膜铺片上,不同观察者计算的视网膜新生血管及无灌注区面积α值分别为0.626、0.972.结论 利用OIR模型研究视网膜新生血管时,异凝集素染色视网膜铺片和硫氰酸葡聚糖荧光素心脏灌注视网膜铺片均能清晰显示新生血管和无灌注区,前者在量化视网膜新生血管和无灌注区面积时均较可靠,而后者只适合于评价视网膜新生血管的灌注情况.
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早产儿视网膜病变的视网膜前新生血管增生膜组织病理学观察
目的 研究早产儿视网膜病变(ROP)的视网膜前新生血管增生膜(视网膜前增生膜)组织病理学特点及其发病机制.方法 回顾性系列病例研究.对24例(34只眼)手术获取的5期ROP视网膜前增生膜进行光镜观察,其中15例(15只眼)再行透射电镜观察,取2例(2只眼)行神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)染色.应用SPSS 11.0统计学软件,对ROP视网膜前增生膜的新生血管数与相关临床因素进行Spearman等级相关分析;应用STATA 7.0统计学软件,对视网膜前增生膜的成纤维细胞数与相关临床因素进行随机效应模型分析.结果 光镜下观察,可见视网膜前增生膜以胶原纤维为主,新生血管和细胞分布不均,新生血管数与早产儿出生后周龄、校正周龄呈负相关(r=-0.469,-0.482;均P<0.05),与孕周和出生体重无关(r=-0.179,-0.272;均P>0.05),成纤维细胞数与患儿的孕周、出生后周龄、校正周龄呈负相关(Z=-1.99,-3.45,-3.64;均P<0.05),与出生体重无关(Z=0.21,P>0.05).透射电镜下观察,可见视网膜前增生膜中有多种细胞成分,包括成纤维细胞、肌纤维母细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞、炎性细胞等.GFAP染色证实ROP的视网膜前增生膜中存在神经胶质细胞,且多分布在视网膜表面.结论 ROP视网膜前增生膜的主要细胞成分是成纤维细胞和肌纤维母细胞,视网膜前增生膜的退化与患儿出生后周龄和校正周龄相关,但与出生体重无关.神经胶质细胞在ROP视网膜前增生膜的形成中扮演重要角色.
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组织蛋白酶B抑制剂干预鼠视网膜新牛血管形成的研究
目的 探讨组织蛋白酶B(Cathepsin B)抑制剂CA-074Me对视网膜新生血管形成的干预作用.方法 实验研究.将C57BL/6J 7日龄小鼠60只用随机数字表法分为正常对照组、空白对照组、阴性对照组和实验组,每组15只,空白对照组、阴性对照组和实验组在缺氧环境中建立视网膜新生血管模型.实验组小鼠出氧箱后每眼球周注射CA-074Me 5 mg·kg-1·d-1,阴性对照组球周注射与实验组溶剂等量的二甲基亚砜,正常对照组、空白对照组均不给予任何药物,连续5 d.测定眼组织组织蛋白酶B活性;通过免疫组织化学的方法 观察组织蛋白酶B在视网膜组织的表达;通过HE染色法测定不同组突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数目;通过视网膜ADP酶染色铺片,测量无血管区面积、无血管区面积与视网膜面积的比值.结果 正常对照组、空白对照组、阴性对照组、实验组组织蛋白酶B活性分别为(17.75±2.30)、(28.75±3.14)、(29.16±2.78)、(23.14±3.53)nmol·min-1·mg-1,实验组分别与各对照组比较,两组之间差异均有统计学意义(F=13.16,P＜0.01),阴性对照组与空白对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05);免疫组化测定正常对照组、空白对照组、阴性对照组和实验组组织蛋白酶B平均吸光度值分别为0.24±0.02、0.35±0.05、0.36±0.07、0.35±0.01,实验组、空白对照组、阴性对照组之间两两比较,差异均无统计学意义(P＞0.05);视网膜石蜡切片HE染色后,正常对照组、空白对照组、阴性对照组、实验组平均每张切片中突破内膜新生血管内皮细胞核数分别为2.71±1.07、67.51±11.55、65.16±5.78、27.14±3.53,实验组与各对照组比较差异均有统计学意义(F=9.12,P＜0.01),阴性对照组与空白对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05);正常对照组、空白对照组、阴性对照组、实验组无血管区面积分别为(1.17±0.30)、(5.34±0.74)、(5.16±0.68)、(2.38±0.53)mm2,实验组与各对照组比较差异均有统计学意义(F=7.57,P＜0.01),阴性对照组与空白对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05);正常对照组、空白对照组、阴性对照组和实验组无血管区面积/视网膜面积分别为0.09±0.01、0.24±0.03、0.23±0.07,0.16±0.05,实验组与各对照组比较差异均有统计学意义(F=8.32,P＜0.01),阴性对照组与空白对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 组织蛋白酶B抑制剂CA-074 Me对C57BL/6J小鼠视网膜新生血管形成有一定程度的抑制作用,有可能成为治疗视网膜新生血管的一种新的方法 .(中华眼科杂志,2008,44:207-211)
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甲巯咪唑诱导的低浓度血清IGF-1对高氧所致新生大鼠视网膜新生血管的影响作用研究
目的 了解甲巯咪唑(MMI)对氧诱导的新生大鼠视网膜病变的影响,以期进一步明确低浓度血清胰岛素样生长因子-1(IGF-1)是否为早产儿视网膜病变的危险因素.方法 实验研究.新生SD大鼠96只,随机分为4组,分别为循环氧组:幼鼠出生后在循环氧条件下饲养14 d后,置于空气环境中4 d,母鼠饮用普通自来水;对照组及MMI组:幼鼠皆于空气中饲养18 d,母鼠分别饮用普通自来水和含0.1%MMI的水;"循环氧+MMI"组:循环氧组实验条件下的母鼠饮用含MMI的水.每组取右眼进行视网膜铺片和二磷酸腺苷(ADP)酶染色,左眼行石蜡切片后计数突破视网膜内界膜的细胞核数目,对视网膜血管进行评估;用放射免疫分析法进行血清IGF-1的测定.同时观察各组新生鼠体重的变化.采用x2检验方法比较各组新生血管发生率,成组t检验或单因素方差分析比较各组视网膜无血管区占整个视网膜面积的比值、视网膜血管密度、内界膜前血管内皮细胞核计数和各组间血清IGF-1浓度.结果 循环氧组同"循环氧+MMI"组相比,NV的发生率分别为26%和57%(x2=4.38,P=0.04);视网膜内界膜前血管内皮细胞核计数分别为(33.17 ±3.06)和(65.64±3.85)(t=17.73,P=0.00),差异均有统计学意义;"循环氧+MMI"组视网膜无血管区占整个视网膜面积的6.37%±1.23%,其余各组视网膜血管发育至周边部;对照组、MMI组、循环氧组及"循环氧+MMI"组间视网膜血管密度分别为95.21±6.17、52.57±4.14、68.82±3.71、64.20±4.26.差异有统计学意义(F=331.74,P=0.00);血清IGF-1含量分别为(536.43±32.65)、(235.94±29.09)、(526.50±26.83)、(227.24 ±19.59)mg/L,差异有统计学意义(F=278.57,P=0.00).饮用普通自来水的对照组和循环氧组幼鼠生长发育基本正常,而饮用MMI的MMI组和"循环氧+MMI"组幼鼠可见明显的生长发育迟缓.结论 研究显示MMI能加重高氧诱导的新生大鼠视网膜新生血管的发生率和严重程度.低浓度血清IGF-1可能是非氧相关调节中重要的因素之一,其调控新生血管形成的机制有待于进一步研究.
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高氧诱导小鼠视网膜病变模型中血管内皮生长因子和色素上皮衍生因子的表达及意义
目的 研究高氧诱导小鼠视网膜病变模型中血管内皮生长因子(VEGF)和色素上皮衍生因子(PEDF)的表达和意义,并探讨两者在视网膜新生血管形成过程中的作用.方法 对照实验研究.对新生C57BL-6N系小鼠给予高氧后,置相对低氧环境中饲养,诱导产生视网膜新生血管.在小鼠生后第12、14及17天摘除眼球,通过逆转录聚合酶链反应和免疫印迹法及荧光素灌注造影,分别检测不同时间点全视网膜新生血管组织对VEGF与PEDF的mRNA和蛋白质的表达水平的差异,并观察视网膜新生血管的分布与形态变化,通过血管内皮细胞计数对新生血管进行量化.应用SPSS11.5统计学软件,采用析因设计方差分析,分别比较实验组与对照组mRNA与蛋白质表达水平的差异,以P<0.05作为差异有统计学意义.结果 在高氧环境中(出生第12天小鼠),OIR模型鼠VEGF蛋白质表达A值(0.47±0.12)较正常鼠(1.81±050)下降,PEDF蛋白质表达A值(5.35±0.94)较正常鼠(0.68±0.17)明显升高;而相对低氧环境中(出生第14和17天小鼠),VEGF蛋白质表达A值(2.15±0.46,5.49±0.97)较正常鼠(0.90±0.05,0.88±0.91)明显升高,PEDF蛋白质表达A值(2.07±0.35,1.37±0.48)较正常鼠(2.62±0.68,5.30±0.59)明显下降,尤以第17天下降显著.对不同时间点VEGF和PEDF蛋白质表达水平进行析因方差分析,结果显示各时间点的VEGF蛋白质表达水平差异有统计学意义(F=70.450,P=0.000),各时间点的PEDF蛋白质表达水平差异有统计学意义(F=160.237,P=0.000).出生第12、14及17天小鼠视网膜VEGF蛋白质的表达与正常对照组比较,差异有统计学意义(P=0.009,0.010,0.000),PEDF蛋白质的表达差异也有统计学意义(P=0.002,0.046,0.000);出生第12、14及17天小鼠视网膜VEGF mRNA的表达与正常对照组比较,差异有统计学意义(P=0.001,0.000,0.001),PEDF mRNA的表达差异也有统计学意义(P=0.000,0.001,0.000).伴随着视网膜组织的缺氧,出现了VEGF蛋白质表达水平升高和PEDF蛋白质表达水平降低,导致视网膜组织中VEGF与PEDF蛋白质表达失衡;VEGF与PEDF的mRNA表达亦发生类似变化,且较蛋白质改变提前发生.上述改变均伴随着同期视网膜新生血管的发生、发展及其严重程度而逐渐加重.结论 VEGF和PEDF的mRNA和蛋白质表达失衡可能足造成视网膜新生血管发生的机制之一.(中华眼科杂志,2008,44:734-740)
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体外转染人发状分裂相关增强子-1基因重塑视网膜新生血管的研究
目的探讨体外转染人发状分裂相关增强子1(HESR-1)基因至视网膜血管内皮细胞并重塑视网膜新生血管的可行性.方法将HESR-1克隆至pcDNA 3.1+载体内,组成pcDNA 3.1+ HESR-1重组质粒,原代培养人视网膜血管内皮细胞,实验中加入10 ng血管内皮生长因子(VEGF)刺激内皮细胞生长,模拟体内新生血管内皮细胞激活状态,以脂质体转染pcDNA 3.1+ HESR-1重组质粒至培养的细胞内,应用免疫组织化学法检测血管内皮生长因子(VEGF)第2受体(KDR)和紧密连接蛋白(occludin)表达的阳性率,采用免疫印迹法分析HESR-1对occludin表达的调控作用,体外建立视网膜血管模型,检测HESR-1对血管通透性的影响.结果 HESR-1基因成功转染至血管内皮细胞,KDR表达阳性率下降,occludin表达增强.重塑的体外血管样结构通过HESR-1的作用能降低血管通透性.结论 HESR-1基因能下调KDR的表达,增强occludin的表达,减少血管渗漏,达到重塑视网膜新生血管的目的;可为视网膜新生血管的治疗提供新的思路和方法.(中华眼科杂志,2005,41:1027-1032)
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15-脂氧合酶-1过表达抑制氧诱导小鼠视网膜新生血管的机制研究
目的 探讨15-脂氧合酶-1(15-LOX-1)过表达抑制氧诱导小鼠视网膜新生血管的作用及其机制.方法 实验研究.将88只7日龄C57BL/6J小鼠随机分为正常对照组、诱导模型组、基因治疗组和空白载体组,每组22只.将小鼠与哺乳母鼠共同置于氧浓度为75％±2％的氧箱内饲养5d后转移至正常氧环境中饲养5d,建立氧诱导视网膜病变(OIR)模型.小鼠出生后第12天,基因治疗组玻璃体腔注射Ad-15-LOX-1-EGFP 1.0μl;空白载体组注射等量Ad-EGFP.注射后第5天行实时荧光定量PCR和免疫印迹法分别检测视网膜15-LOX-1、过氧化物酶增殖活化受体Y(PPAR-γ)、血管内皮生长因子-A(VEGF-A)和血管内皮生长因子受体2(VEGFR-2)的mRNA和蛋白表达;行FITC-dextran荧光素造影视网膜铺片观察并测量视网膜无灌注区和新生血管的相对面积;行石蜡切片HE染色计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数目.分别采用秩和检验和单因素方差分析进行组间数据的比较.结果 基因治疗组15-LOX-1和PPAR-γ mRNA及蛋白表达水平(15-LOX-1:2.17±0.25,1.45 ±0.10; PPAR-γ:2.12 ±0.29,0.85 ±0.03)明显高于诱导模型组(15-LOX-1∶0.62 ±0.03,0.66 ±0.04;PPAR-γ:0.67 ±0.18,0.48 ±0.03)和空白载体组(15-LOX-1∶0.51 ±0.14,0.57 ±0.03;PPAR-γ:1.07±0.09,0.52±0.02)(t15-LOX-1=12.511、13.402,P值均＜0.01;tPPAR-r =9.420、6.813,P值均＜0.01);与之相反,基因治疗组VEGF-A和VEGFR-2 mRNA及蛋白表达水平(VEGF-A∶0.87±0.07,0.34 ±0.01;VEGFR-2∶1.02±0.12,0.45 ±0.03)明显低于诱导模型组(VEGF-A:3.49±0.53,0.74±0.04;VEGFR-2∶2.28±0.44,0.82±0.01)和空白载体组(VEGF-A∶2.30±0.25,0.69±0.02;VEGFR-2:1.88±0.16,0.76±0.03)(tVEGF-A=10.662、5.843,P值均＜0.01; tVEGFR-2=6.731、4.763,P值均＜0.01).基因治疗组中视网膜无灌注区(5.88 ± 1.12)和新生血管面积(9.37±1.85)均较诱导模型组(21.25 ±2.87;24.13 ±4.29)和空白载体组(19.50±1.78;23.13 ±3.52)显著减小(t=9.404～17.312,P值均＜0.01);基因治疗组中突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数目(1.25±0.89)与诱导模型组(60.63±10.82)和空白载体组(54.63 ±7.63)比较亦明显减少(Nemenyi检验:P值均＜0.01).结论 15-LOX-1过表达通过上调PPAR-γ,下调VEGF-A和VEGFR-2的表达发挥抑制氧诱导小鼠视网膜新生血管的作用.
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血管内皮生长因子受体KDR基因胞外段1-3区基因转染抑制氧诱导小鼠视网膜新生血管的研究
目的 评价脂质体介导的血管内皮生长因子受体KDR基因胞外段1-3区(KDRn3)基因转染抑制氧诱导的视网膜新生血管的效果.方法 选1周龄C57Bl/6N小鼠置于氧浓度为75%±2%的氧箱中5 d.回到正常环境中诱导视网膜新生血管模型.在小鼠离开氧箱的当日,向转染组小鼠玻璃体腔注射脂质体pEGFP-N1/KDRn3复合物1 μl;脂质体对照组注射等量脂质体;空白对照组小鼠注射等量PBS.回到正常环境中后5 d,采用视网膜铺片及视网膜冰冻切片在激光共聚焦显微镜下观察绿色荧光蛋白在视网膜的表达;采用荧光标记的右旋糖酐血管灌注下视网膜铺片方法观察视网膜新生血管的分布并测量无灌注区面积;组织学切片观察比较突破视网膜内界膜的血管内皮细胞数量.多组比较采用方差分析,有统计意义后进行两两比较的q检验.结果 转染组视网膜铺片见视网膜局部散在点状绿色荧光信号,空白对照组与脂质体对照组未见绿色荧光信号;视网膜冰冻切片见转染组视网膜神经节细胞层、内核层部分细胞胞质内见绿色荧光表达,空白对照组与脂质体对照组视网膜各层未见绿色荧光表达;视网膜铺片观察可见空白对照组与脂质体对照组在无灌注区边缘均可见新生血管芽及荧光渗漏,转染组见新生血管芽明显减少,生后第17天A、B、C 3组新生血管模型小鼠各组视网膜无灌注区面积分别为(1.33±0.49)、(2.75±0.70)、(2.12±0.35)mm2,组间比较差异有统计学意义(F=17.61,P＜0.01＝.正常对照组及A、B、C组视网膜表面突破内界膜的血管内皮细胞核计数分别为0.20±0.51、13.58±2.48、23.05±3.40及21.70±2.89,组间比较差异有统计学意义(F=1085.25,P＜0.05＝.结论 pEGFP-N1/KDRn3基因转染可不同程度抑制氧诱导C57,Bl/6J小鼠视网膜新生血管的生长.
关键词： 血管内皮生长因子受体2 转染 视网膜新生血管化 小鼠 -
高氧诱导小鼠视网膜新生血管模型中端粒酶逆转录酶的表达变化
目的 研究高氧诱导视网膜新生血管模型中小鼠端粒酶逆转录酶(TERT)基因表达水平是否有变化,为进一步研究视网膜新生血管疾病的预防和治疗提供新的靶点.方法 实验研究.选取7 d龄C57BL/6J新生小鼠32只,分高氧组和对照组,每组16只.高氧组小鼠以密闭氧箱内以75%±2%氧浓度饲养5 d后置于正常氧浓度环境中,正常对照组小鼠于正常氧环境中饲养.于小鼠生后12、14及19 d时分别取高氧组和对照组小鼠各2只(4只眼),经尾静脉行2%伊文思蓝溶液灌注并做视网膜铺片,荧光显微镜下观察视网膜新生血管的形成情况.高氧模型组和正常对照组生后19 d幼鼠3只,行HE染色,光学显微镜下观察视网膜血管形态,观察突破内界膜的内皮细胞核数.取生后19 d高氧组和对照组小鼠,分别取其视网膜组织并提取总RNA,反转录成cDNA后行反转录PCR,2%琼脂糖凝胶电泳并照相.提取视网膜总RNA,反转录成cDNA后(同RT-PCR),配制荧光定量实时PCR反应体系(总计20μl),在60℃检测荧光信号,分析图像.分别取高氧模型组和正常对照组P19小鼠行眼球切片,常规处理后TERT抗体孵育37℃ 60 min,HRP酶标二抗孵育30 min,DAB显色,中性胶封片,镜下观察并照相.结果高氧诱导模型小鼠牛后12 d眼底后极部出现大片无灌注区,生后14 d眼底后极部出现新牛血管迂曲、渗漏等视网膜血管病变.生后17～19 d视网膜新生血管形成达到高峰.正常小鼠视网膜组织切片HE染色基本看不剑突出内界膜的血管芽及血管管腔,内界膜下视网膜内的血管内皮细胞核散在分布、数量较少;高氧组见大量突出内界膜伸向玻璃体腔的血管管腔及血管芽,内界膜下视网膜内也有大量血管内皮细胞增生.19 d高氧模型组小鼠视网膜TERT及bFGF mRNA表达较同日龄正常对照组小鼠明显提高,二者差异有统计学意义(F=8.575,5.667;P＜0.05).生后19 d实时PCR检测高氧模型组小鼠视网膜TERT mRNA表达较同日龄正常对照组小鼠明显上调,差异有统计学意义(F=173.104,P＜0.05).生后19 d高氧诱导小鼠视网膜新生血管模型中视网膜新生血管TERT表达阳性,同日龄对照组新生小鼠视网膜血管TERT表达阴性.结论高氧诱导视网膜新生血管小鼠模型中端粒酶逆转录酶和新生血管形成相关因子表达水平明显上调,可能会成为视网膜新生血管疾病预防和治疗的新靶点.(中华眼科杂志,2009,45:199-205)
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奥曲肽抑制视网膜新生血管形成的实验研究
目的探讨生长抑素类似物奥曲肽对视网膜新生血管形成的影响及其治疗作用.方法将鼠龄7 d的小鼠40只随机分为5组,每组8只.正常对照组于正常空气环境中饲养,不予任何处理;其他4组置于氧箱中饲养.实验组分别皮下注射奥曲肽20和50 μg*kg-1*d-1,实验对照组皮下注射等量PBS,连续用药5 d,高氧组不注射奥曲肽.将鼠龄17 d的小鼠处死,摘除眼球制作标本,进行组织病理学及电镜观察.光镜下观察并计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数.原位杂交法检测生长抑素受体2(SSTR2)在视网膜上的表达.电镜下观察视网膜组织超微结构的改变.结果正常对照组标本HE染色几乎未见突破内界膜的血管内皮细胞核,高氧组和实验对照组可见较多的突破内界膜的血管内皮细胞核,而实验组的数目明显少于高氧组和实验对照组.SSTR2原位杂交染色可见正常对照组、高氧组、实验对照组视网膜神经节细胞层、内核层及血管内皮细胞SSTR2强阳性表达,实验组呈弱阳性表达,其中大剂量实验组的表达更弱于小剂量实验组.电镜下可见缺氧引起小鼠视网膜视细胞层的破坏,奥曲肽治疗后,视网膜超微结构的损害明显好转.结论奥曲肽能有效抑制视网膜新生血管的形成,在一定程度上可预防缺氧造成的视网膜超微结构的损害.
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Pyk2在高氧诱导小鼠视网膜新生血管模型中的表达研究
目的 探讨高氧诱导小鼠视网膜新生血管模型中富含脯氨酸的酪氨酸激酶2(Pyk2)基因表达水平的变化.方法 实验研究.选取7日龄C57 BL/6J新生小鼠144只,分为高氧组和对照组,每组72只.高氧组小鼠在密闭氧箱内以(75±2)％氧浓度饲养5d后置于室内空气环境中；对照组小鼠一直处于室内空气环境中饲养.两组小鼠于出生后12、14、17 d分别处死8只,进行组织病理学切片检查和视网膜铺片.实时荧光定量PCR检测Pyk2和血管内皮生长因子(VEGF)在视网膜组织中的表达水平.多组间均数比较采用两因素方差分析,组间均数比较采用SNK-q检验；同一时间点两组间数据比较采用t检验.结果 组织病理学切片检查结果可见,高氧组小鼠出生后14 d(15.36±3.69)和17 d(29.63 ±4.69)有大量突破视网膜内界膜的内皮细胞核及血管芽,与对照组(0.97±1.00、0.83 ±0.79)相比差异有统计学意义(t14 d=- 20.629,P14d =0.000;t17d=-33.814,P17d=0.000).视网膜铺片检查结果可见,高氧组小鼠出生后12 d视网膜血管明显收缩、阻塞,视网膜大片区域无灌注,出生后14 d新生血管开始形成,出生后17 d新生血管形成达到高峰.实时荧光定量PCR检测结果可见,与对照组(Pyk2:12 d:1.00 ±0.14,14 d:0.71±0.20,17 d:0.67±0.15;VEGF:12 d:1.00±0.13,14 d:0.88 ±0.14,17 d:0.94 ±0.15)相比,高氧组出生后12 d Pyk2(0.05±0.03)和VEGF(0.10 ±0.06) mRNA表达量均降低(t=15.706,P=0.000;t=15.911,P=0.000),而出生后14 d和17 d Pyk2(1.11 ±0.22、1.68±0.30)和VEGF(2.10±0.41、4.85±0.46)表达量增高(Pyk2:t14d=-3.376,P14d =0.007;t17d=-7.358,P17d =0.000;VEGF:t14d=-6.904,P14d=0.000;f17d=- 19.667,P17d=0.000).结论 高氧诱导小鼠出生后14 d和17 d视网膜组织中Pyk2的表达水平增高,Pvk2可能参与高氧诱导的视网膜新生血管形成.
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内皮抑素基因转移抑制视网膜新生血管的实验研究
目的评价脂质体介导的内皮抑素(ES)基因转移抑制缺氧诱导的小鼠视网膜新生血管的效果.探讨基因转移抑制视网膜新生血管的可行性.方法制备阳离子脂质体及PCDNA3-ES复合物.选1周龄C57Bl/6N小鼠置于氧浓度为(75±2)%的氧箱中5 d.回到正常环境中诱导视网膜新生血管模型.在小鼠离开氧箱的当日,向ES注射组鼠玻璃体腔注射2 μl脂质体PCDNA3-ES复合物;载体对照组注射等量脂质体空白载体复合物;空白对照组小鼠注射等量PBS.采用ES抗体免疫组化方法检测ES蛋白在视网膜的表达;回到正常环境中后5 d,采用荧光标记的右旋糖酐血管灌注下视网膜铺片方法观察视网膜新生血管的分布;组织学切片观察比较突破视网膜内界膜的血管内皮细胞数量;透射电镜观察ES转移对视网膜超微结构的影响.结果免疫组化检查发现ES 注射组小鼠玻璃体腔注射ES后24 h 开始有ES表达,主要位于视网膜神经纤维层细胞中,维持至少2周仍见表达;视网膜铺片观察可见空白对照组在无灌注区边缘均可见新生血管芽及荧光渗漏.ES注射组见新生血管芽明显减少;组织学检查ES注射组较其他两组突破视网膜内界膜的细胞数量减少,差异有统计学意义;ES转移后电镜下视网膜各层超微结构未见明显改变.结论采用玻璃体腔注射方法行脂质体介导的内皮抑素基因转移可以一定程度抑制缺氧诱导的小鼠视网膜新生血管生长,对视网膜无明显的毒副作用.应进一步优化转移条件以提高治疗效果.
