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caspase-3、bcl-2蛋白在非霍奇金淋巴瘤组织的表达及其与细胞凋亡和增殖的关系
目的探讨caspase-3、bcl-2蛋白在非霍奇金淋巴瘤(NHL)发生、发展中的可能作用及相互关系.方法应用TdT介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)技术和免疫组织化学链霉素抗生物素-过氧化酶(SP)法,检测5例反应性增生淋巴组织和119例NHL组织中的细胞凋亡和增殖细胞核抗原(PCNA)、caspase-3、bcl-2蛋白的表达水平.结果 caspase-3和bcl-2在119例NHL中表达的阳性率分别为86.6%(103例)和53.8%(64例).二者在良、恶性淋巴组织中的表达方式相反:在反应性增生淋巴滤泡中心caspase-3高表达而bcl-2阴性表达,滤泡套区caspase-3阴性表达而bcl-2高表达;在肿瘤性滤泡中心bcl-2常高表达而caspase-3常表达减弱或不表达;在NHL中二者的表达与肿瘤恶性度呈相反关系,高度恶性组中caspase-3的表达(44.4%)高于低度恶性组(23.7%,P<0.01),而B细胞性淋巴瘤中bcl-2的表达(42.6%)低于低度恶性组(75.5%,P<0.01);caspase-3的表达与凋亡指数呈正相关(r=0.512, P <0.01)),bcl-2的表达与凋亡指数呈负相关(r=-0.436, P<0.01).此外,NHL的凋亡指数与增殖指数呈显著正相关(r=0.710, P<0.01).结论 caspase-3可能参与了NHL的凋亡调节机制.caspase-3和bcl-2蛋白在良、恶性淋巴组织中常呈现相反的表达方式,提示二者在淋巴细胞增殖动力学调节中可能存在着密切联系.
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稳定过表达Smac基因对胃癌细胞株凋亡活性的调控作用
目的探讨稳定过表达Smac 基因对胃癌细胞凋亡的影响.方法脂质体介导Smac基因转染MKN-45细胞,G418筛选阳性克隆.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western 印迹鉴定Smac表达,同时以丝裂霉素作为凋亡诱导因子,采用锥虫蓝活细胞拒染法检测癌细胞体外生长活性,透射电镜、吖啶橙-溴化乙啶荧光染色法、末端TdT酶标记技术(TUNEL)观察癌细胞凋亡及比率;Western印迹、比色法检测细胞内caspase-3表达.结果所获胃癌亚克隆细胞MKN-45/Smac的Smac mRNA、蛋白表达水平均显著高于MKN-45(P<0.01).10 μg/ml 丝裂霉素作用6～24 h后,与MKN-45细胞比较,MKN-45/Smac细胞生长活性减弱10.0%～30.8%(P<0.01),部分MKN-45/Smac细胞发生典型的凋亡形态学改变,凋亡率增高21.2%(P<0.01).丝裂霉素作用后,MKN-45/Smac细胞内caspase-3的表达和活性均较MKN-45细胞显著增强(P<0.01).结论胃癌细胞中Smac基因的过表达,能提高丝裂霉素作用后细胞中caspase-3的表达和活性,显著诱导癌细胞凋亡,为调控胃癌细胞凋亡活性提供了新的途径.
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重构型天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3表达载体诱导人肺腺癌细胞凋亡的意义
目的构建天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)表达载体,观察Caspase-3表达载体对人肺腺癌A549细胞凋亡的影响.方法应用基因重组方法,建立重构型Caspase-3基因的真核表达系统pcDNA3.1-rev-Caspase-3质粒和野生型pcDNA3.1-Caspase-3质粒.将实验细胞分为3组:转染pcDNA3.1-rev-Caspase-3质粒组,转染pcDNA3.1-Caspase-3质粒组,转染pcDNA3.1质粒空白对照组.前2组用Caspase-3抑制剂DEVD-fmk干预.应用Caspase-3酶活性分析、流式细胞仪及甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测A549细胞Caspase-3酶活性变化及细胞凋亡和增殖情况.结果 (1) pcDNA3.1-rev-Caspase-3质粒组、pcDNA3.1-Caspase-3质粒组的A549细胞Caspase-3酶活性分别是(11.87±0.92)%、(5.34±0.38)% (t=16.02, P<0.01);用Caspase-3抑制剂DEVD-fmk干预后,pcDNA3.1-rev-Caspase-3质粒组酶活性为(7.04±0.48)%,仍明显高于野生型pcDNA3.1-Caspase-3质粒组的(4.51±0.20)%(t=11.86, P<0.01).(2)流式细胞分析结果显示,pcDNA3.1-rev-Caspase-3质粒组、pcDNA3.1-Caspase-3质粒组和pcDNA3.1质粒组的A549细胞凋亡率分别是(20.1±3.5)%、(7.8±2.8)%、(1.4±0.3)%,3组差异有统计学意义(F=44.01,P<0.01).(3)MTT比色检测显示pcDNA3.1-rev-Caspase-3质粒组、pcDNA3.1-Caspase-3质粒组和pcDNA3.1质粒组的A549细胞生存率分别是(35.7±1.1)%、(72.8±2.9)%、(85.4±4.8)%,转染pcDNA3.1-rev-Caspase-3质粒组生存率明显低于其他两组(F=375.07,P<0.01).结论 pcDNA3.1-rev-Caspase-3在A549细胞内有较强的自身活化能力,对Caspase-3抑制剂抵抗作用较强,可明显诱导A549细胞凋亡并抑制A549细胞生长.
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一氧化氮可能参与多巴胺对PC12细胞凋亡的诱导作用
目的探讨多巴胺(DA)诱导的PC12细胞凋亡是否与内源性一氧化氮(NO)生成有关. 方法酶还原法测定NO浓度,RT-PCR法检测诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和caspase-3 mRNA表达水平,免疫细胞化学方法和蛋白印迹法分别检测活化型caspase-3蛋白和iNOS蛋白水平. 结果在多巴胺诱导PC12细胞凋亡过程中,iNOS mRMA和蛋白表达明显增加,内源性NO生成增多;caspase-3 mRNA和活化型caspase-3蛋白的表达也明显增加. 结论内源性NO可能参与多巴胺对PC12细胞凋亡的诱导作用.
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Caspase-8在5氟尿嘧啶诱导肝癌细胞凋亡中的作用
目的探讨5氟尿嘧啶(5-Fu)诱导肝癌细胞凋亡与caspase-8活性变化的关系.方法采用caspase-8荧光检测试剂盒检测HepG2细胞凋亡过程中caspase-8活性变化.流式细胞仪检测加入caspase-8抑制剂IETD-FMK后5-Fu诱导的HepG2细胞凋亡百分率的变化.结果不同浓度的5-Fu均可诱导HepG2细胞caspase-8活性升高,高浓度与低浓度比较差异有显著意义(P＜0.001).肝癌细胞的caspase-8活性随5-Fu作用时间延长而逐步升高,至16h后达到高峰.IETD-FMK能阻断caspase-8活化而抑制5-Fu诱导的HepG2细胞凋亡.结论5-Fu通过caspase-8信号传导通路诱导肝癌细胞凋亡;5-Fu诱导caspase-8活性升高有浓度与时间依赖性.
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缺血预处理对肝硬化肝癌患者入肝血流阻断肝切除的保护作用及其机理探讨
目的探讨缺血预处理(IPC)对肝硬化肝癌患者入肝血流阻断肝切除的保护作用及其机理. 方法将近期手术切除的29例原发性肝癌(HCC)随机分为2组:IPC组(n=14):肝门阻断切肝前先给予缺血5 min,灌注5 min的缺血预处理;对照组(n=15):单纯肝门阻断切肝.比较2组术前后肝功能的变化和肝灌注1 h时肝组织caspase-3活性和细胞凋亡的情况. 结果术后1、3、7 d,IPC组的天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)明显低于对照组(t=4.238,P<0.05);术后3、7 d,IPC组的总胆红素(TBIL)明显低于对照组(t=2.296,P<0.05);术后1 d,IPC组的ALB高于对照组,但无统计学差异(t=2.029,P>0.05).术后1 h,IPC组肝组织caspase-3活性和凋亡的内皮细胞均明显低于对照组(t=2.349, P<0.05). 结论 IPC对肝硬化肝癌患者入肝血流阻断肝切除术后肝功能有良好的保护作用,其保护机理是通过抑制caspase-3的活性,从而抑制肝窦内皮细胞来实现的.
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外源性FasL基因诱导肺癌细胞Caspase-3的表达及凋亡
目的:研究FasL基因转染肺癌细胞中Caspase-3的表达及与细胞凋亡的关系.方法:RT-PCR、流式细胞术和免疫组化检测Caspase-3在FasL基因转染的A-549/FasL细胞中的表达,流式细胞术、原位末端标记(TUNEL)检测细胞凋亡.结果:Caspase-3在A-549母系细胞中低水平表达,转基因后的A-549/FasL细胞的Caspase-3的表达和活性显著升高,P＜0.01.同时肺癌细胞凋亡率升高(44.08% vs 18.15%,P＜0.01).凋亡率与Caspase-3的活性呈明显正相关关系,γ=0.647,P＜0.01.肿瘤细胞中的凋亡与其Caspase-3的表达有明显的关系.结论:Caspase-3在肺癌发生中起重要作用,FasL基因转染的肺癌细胞的凋亡与其Caspase-3的表达增加有密切关系.
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FasL和Caspase-3在胃癌中表达及相关免疫逃逸机制
目的:研究Fas配体(FasL)和Caspase-3表达在胃癌发生和演进中的作用.方法:利用免疫组化方法检测FasL和Caspase-3在113例胃癌旁上皮细胞、原发灶癌细胞和淋巴细胞以及转移灶癌细胞中的表达,比较原发灶癌细胞中两种蛋白表达与胃癌病理特征的关系,探讨原发灶癌细胞中FasL表达与原发灶癌细胞或浸润淋巴细胞中Caspase-3表达的关系.结果:FasL在原发灶癌细胞中阳性表达率高于癌旁上皮细胞(53.98% vs 34.51%),P<0.05,Caspase-3则有相反趋势(32.74% vs 50.44%),P<0.05.70.80%原发灶浸润淋巴细胞中Caspase-3呈阳性表达,显著高于原发灶癌细胞和癌旁上皮细胞中的阳性率,P<0.05.FasL在转移灶癌细胞中阳性表达率低于对应原发灶癌细胞(51.16% vs 81.58%),P<0.05,Caspase-3则有相反趋势(58.14% vs 34.21%),P<0.05.原发灶癌细胞中 FasL表达与胃癌肿块大小、浸润深度、转移、分化和lauren分型显著相关,P<0.05.原发灶癌细胞中FasL表达与其浸润淋巴细胞中Caspase-3表达呈正相关,P<0.05.结论:FasL表达上调和Caspase-3表达下调在胃癌发生中起到重要作用.FasL可能通过诱导浸润淋巴细胞凋亡而参与胃癌分化、浸润和转移,可作为一种反映胃癌生物学行为的有效指标.胃癌原发灶和转移灶分泌的化学物质可能通过调节转移癌细胞中FasL和 Caspase-3表达来抑制转移癌细胞生长.
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Bcl-2及Pan caspase-1蛋白在胃腺癌组织中的表达及临床意义
目的:研究bcl-2及Pan caspase-1在胃腺癌组织中的表达,进一步探讨bcl-2及Pan caspase-1对胃腺癌细胞凋亡基因蛋白的影响,为临床正确判断肿瘤细胞的生物学行为及估计患者预后筛选可靠生物学指标.方法:收集2001年1月～2002年2月酒泉钢铁公司医院胃腺癌手术标本蜡块54例.其中低分化胃腺癌32例,高分化22例.采用SP免疫组化法, 严格按照SP超敏试剂盒的说明操作,显微镜下观察Pan caspase-1和bcl-2在胞质/胞核中的表达.并结合F-ⅧR Ag检测,测量MVD值.结果:Pan caspase-1在低分化腺癌表达为21.9%,高分化表达为72.8%,两者差异有统计学意义,P<0.01.Pan caspase-1表达阳性率在bcl-2阳性表达中低于bcl-2阴性中,P<0.05.肿瘤的MVD在bcl-2和Pan caspase-1的阳性表达中分别高于其阴性表达(P＝0.023 6和P＝0.002 8).而 bcl-2的表达与胃腺癌分化程度无关.结论:Pan caspase-1在癌细胞凋亡有作用,与癌组织分化程度有关.提示检测Pan caspase-1有助于确定癌细胞的分化程度,正确判断胃癌细胞的生物学行为及患者预后.血管形成可能影响胃腺癌癌细胞的凋亡.
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拓扑特肯诱导人肺癌SPC-A-1细胞凋亡作用的研究
目的:研究拓扑特肯(Topotecan,TPT)诱导体外培养的人肺癌SPC-A-1细胞凋亡的作用及其可能的机制.方法:体外培养肺癌细胞,加以20 mg/L的TPT孵育12、24和48 h,用MTT法检测TPT对肺癌细胞增殖的作用;用TUNEL法和流式细胞仪技术检测TPT诱导肺癌细胞凋亡的发生情况及Cas-pase-3特异性拮抗剂Ac-DEVD-CHO(50 μmol/L)对TPT诱导凋亡作用的影响.结果:TPT处理细胞12、24和48 h后,肺癌细胞的存活率分别为(85.8±9.7)%、(76.5±6.5)%和(64.6±10.4)%,未经TPT处理的对照组细胞存活率为(97.1±6.9)%,各组间差异有显著性(P<0.05);流式细胞仪检测其凋亡率分别为(3.4±1.5)%、(11.5±2.8)%和(31.2±4.1)%,各组间差异有显著性(P<0.01);同时TUNEL法可检测到典型的肺癌细胞凋亡形态学特征;Ac-EDVD-CHO和TPT共孵育细胞12、24和48 h后其凋亡率分别为0、(5.5±1.6)%和(18.6±3.7)%,较对应的未加Ac-DEVD-CHO组明显降低(P<0.01).结论:TPT可通过Caspase-3依赖的途径诱导体外培养的人SPC-A-1肺癌细胞凋亡,且与作用时间呈正相关.
关键词： 肺肿瘤/药理学 抗肿瘤药 喜树碱/类似物和衍生物 caspase类 -
单纯疱疹病毒1型感染对原代培养鼠皮质神经元凋亡caspase-3途径的影响
目的了解caspases-3在单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus type 1,HSV-1)感染原代培养鼠皮质神经元中对线粒体的调控作用以及与神经元凋亡的关系.方法用酶标仪检测体外培养小鼠皮质细胞正常组、病毒组、山梨醇组、山梨醇加病毒组、对照组在不同条件下caspase-3发光底物吸收值,测定caspase-3底物的含量.用流式细胞术结合TUNEL方法检测各组细胞凋亡情况及线粒体膜电位变化.结果加入底物后14 h测定A值:正常组为0.394 2、病毒1组为0.240 8、山梨醇组为0.539 2、病毒加山梨醇组为0.465 0,正常组caspase-3含量较阴性对照组增加,病毒组较正常组明显减低,山梨醇组较正常组明显增加,病毒加山梨醇组较山梨醇组减低.山梨醇及神经酰胺组细胞线粒体膜电位明显降低,而病毒组及病毒加山梨醇或神经酰胺组均无明显降低.结论正常体外培养的神经元存在细胞凋亡,病毒能够阻止线粒体膜电位的超极化,山梨醇诱导的神经细胞凋亡是依赖于caspase-3的细胞凋亡,HSV-1阻止依赖于caspase-3的细胞凋亡途径.
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人端粒酶逆转录酶启动子调控下活性半胱氨酸蛋白酶-3治疗人卵巢癌
目的 构建人端粒酶逆转录酶启动子(hTERTp)调控下的活性半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)重组腺病毒载体并检测其对人卵巢癌的治疗作用.方法 构建表达hTERTp调控下活性caspase-3的重组腺病毒载体AdHT-rev-casp3;以CMV启动子调控下活性caspase-3的重组腺病毒载体Ad-rev-casp3为对照,分别应用Western印迹、细胞计数试剂盒(CCK-8)法、流式细胞术和TUNEL检测AdHT-rev-casp3作用后卵巢癌细胞系AO及正常人脐静脉内皮细胞HUVEC中活性caspae-3蛋白p17和聚腺苷二磷酸-核糖多聚酶(PARP)裂解片段p85的表达水平、细胞存活率和凋亡率;建立裸鼠人卵巢癌皮下及腹腔移植瘤模型,Western印迹检测AdHT-rev-casp3作用后裸鼠肿瘤及肝脏组织中活性caspase-3的表达情况,观测作用前后裸鼠生存率及肿瘤体积的变化以及裸鼠体内肝酶ALT和AST水平.结果 AO细胞在AdHT-rev-casp3(MOI=70)感染后明显表达活性caspase-3蛋白p17和PARP的裂解片段p85蛋白,细胞存活率为55%,凋亡率为26%,而HUVEC在AdHT-rev-casp3感染后无明显p17和p85表达,细胞存活率和凋亡率与阴性对照组差异无统计学意义;AdHT-rev-casp3作用后的裸鼠肿瘤组织中明显表达活性caspase-3,而肝脏组织中则无表达;AdHT-rev-casp3能明显延长荷瘤裸鼠的生存期[(177±12)d vs(106±11)d],抑瘤率为60%,其作用后裸鼠体内的肝酶水平无明显增高.结论 hTERTp系统调控下rev-caspase-3的重组腺病毒AdHT-rev-casp3同时具有较强的致细胞凋亡能力和肿瘤靶向性,能明显抑制卵巢癌移植瘤的生长,延长荷瘤裸鼠的生存期,并明显降低rev-caspase-3对肝脏的毒性作用.
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大鼠脊髓进行性压迫性损伤半胱氨酸蛋白水解酶-12表达与细胞凋亡
目的 探讨大鼠脊髓进行性压迫损伤细胞凋亡、半胱氨酸蛋白水解酶(caspase-12)表达变化规律及其关系.方法 随机选用健康成年Wistar大鼠120只,分为两组:手术组和对照组各60只,每个时间点各10只,按自行设计的方法作脊髓压迫模型;对照组,仅做脊髓显露.分别于术后1、3、7、14、21、28 d观察脊髓受压后细胞凋亡及caspase-12的表达变化系.结果 在各压迫组神经细胞出现凋亡,凋亡的发生率在1、3、7、14、21、28 d分别为12.5%±2.3%、13.0%±3.6%、17.2%±4.3%、29.4%±4.4%、36.1%±6.5%、2.3%±7.9%,并伴随caspase-12的表达增强而增加,14、21、28 d组间比较差异有统计学意义(均P＜0.05).结论 caspase-12可能参与了脊髓进行性压迫缺血所致的细胞凋亡.
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溴氰菊酯对大鼠脑神经细胞凋亡及Caspase-3表达的影响
目的研究Caspase-3在溴氰菊酯(deltamethrin,DM)诱导大鼠脑神经细胞凋亡机制中的作用.方法成年雄性Wistar大鼠腹腔注射12.5 mg/kg的DM染毒,并分成不同时间观察组;以FACS420型流式细胞仪测定大鼠海马和皮层细胞凋亡率和Caspase-3蛋白的表达;以四肽化合物Ac-DEVD-pNa为底物测其神经细胞Caspase-3活力.结果DM染毒后24 h、48 h、5 d组大鼠海马、皮层神经细胞凋亡率[海马:(8.45±1.02)%、(9.44±1.14)%、(7.58±0.75)%,皮层:(7.90±0.49)%、(8.01±0.87)%、(7.97±0.41)%]均高于对照组[海马:(2.97±0.36)%,皮层:(3.50±0.48)%],差异有统计学意义(P＜0.01),而5 h组未见明显变化;DM染毒后5、24、48 h,大鼠海马、皮层神经细胞Caspase-3活力(A405nm吸光度值,海马:0.389±0.038、0.472±0.041、0.295±0.049,皮层:0.321±0.068、0.429±0.077、0.344±0.047)与5 d组大鼠海马Caspase-3活力(0.246±0.065)均明显高于对照组(海马:0.184±0.054,皮层:0.198±0.049),差异有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01);DM染毒后5、24、48h,大鼠脑组织Caspase-3蛋白表达亦明显高于对照组,5 d组未见明显变化.结论DM可影响大鼠脑海马和皮层神经细胞凋亡率、Caspase-3活力及蛋白表达;Caspase-3活力及蛋白表达升高发生在神经细胞凋亡率升高之前,提示其可能是细胞凋亡的上游事件.
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三氯乙烯诱导人角质形成细胞凋亡过程中caspase-8及caspase-9活力的变化
目的 观察三氯乙烯(TCE)致人原代角质形成细胞(KC)损伤过程中caspase-8、caspase-9活力及细胞凋亡率的变化,探讨TCE引起KC凋亡的可能机制.方法 体外培养的KC分别给予0.125、0.250、0.500、1.000和2.000mmol/L的TCE染毒4、8、12、24 h,以100μmol/L的caspase-9特异抑制剂Z-LEHD-FMK预处理细胞1 h,再用2.000mmol/LTCE染毒12 h.MTT法检测细胞活力变化,分光光度法检测caspase-8及caspase-9活力变化.流式细胞仪检测细胞凋亡率变化.结果 与空白对照相比,2.000和1.000 mmol/LTCE染毒组作用8 h后细胞活力降低.染毒超过12 h,各剂量组细胞活力均降低,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01).在不同的时间段,各剂量组的caspase-8活力与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05).染毒8 h时,2.000mmol/LTCE组caspase-9活力明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);12和24h时,各剂量组caspase-9活力与对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01).不同剂量的TCE染毒12 h后,2.000 mmol/L TCE染毒组细胞凋亡率升高至(80.43±4.21)%,空白对照组为(9.40±2.98)%,除0.125 mmol/LTCE组外,其他各染毒组的细胞凋亡率与对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.05),剂量-效应关系明显.Caspase-9抑制剂预处理组caspase-9活力及细胞凋亡率较2.000mmol/L TCE染毒组明显降低,差异有统计学意义(P<0.01).结论 Caspase-9的活化在TCE诱导的体外培养的人KC的凋亡过程中发挥重要作用.
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程序性坏死阻断剂对铝致神经细胞凋亡的影响及其机制
目的 了解程序性坏死阻断剂necrostatin(Nee-1)对铝诱导的神经细胞凋亡的影响,并探讨Nec-1对Caspases凋亡通路的作用机制.方法 用4 mmol/L铝染毒神经母细胞瘤细胞株(SH-SYSY)制备铝致神经细胞死亡模型,在不同浓度铝和(或)Nec-1作用下检测细胞活力的变化,用Heochst 33342/碘丙啶(PI)双染法观察细胞的凋亡和坏死现象,Annexin V/PI双染法定量细胞的凋亡率和坏死率.用Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9酶活力的变化检测凋亡通路,用免疫细胞化学法检测核转录因子(NF-κB)和细胞色素c(Cyt-c)蛋白表达的变化.结果 随着铝染毒剂量的加大,细胞活力明显下降;但加入60 μmol/L Nec-1后,细胞活力明显增强.差异有统计学意义(P<0.05). Nec-1浓度的提高使细胞活力明显上升,表现了明显的促进神经细胞生长、抑制细胞死亡的作用.凋亡和坏死的荧光显微镜观察及流式细胞术定量检测结果 表明,随着铝染毒剂量的增加,神经细胞的凋亡率与坏死率明显上升,但在0～90μmol/L Nec-1作用下,Nec-1浓度越高,细胞的坏死率降低越明显,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01).同时,虽然Nec-1是程序性坏死的阻断剂,但其对凋亡率也有明显的影响,可以使染铝细胞的凋亡率明显下降,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01).对Nec-1作用后细胞的凋亡相关酶Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9活力变化检测结果 表明,Nec-1对Caspase-9活力的影响不明显,且对线粒体通路的凋亡诱导分子Cry-c的作用也不明显;但对Caspase-8活力的影响明显,表现在可以明显降低各染铝细胞的Caspase-8活力,提高NF-κB蛋白表达量和在高剂量染铝细胞中降低Caspase-3的活力.结论 Nec-1可以降低铝诱导的神经细胞凋亡,并通过死亡受体通路Caspase-8上调NF-κB表达,降低细胞凋亡率.
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五价钒致神经细胞凋亡中细胞色素C和caspase-9,3蛋白的变化
目的 研究五价钒致神经细胞凋亡中细胞色素C(Cyt-c)、caspase-9及caspase-3蛋白的变化,为进一步研究五价钒致神经细胞凋亡的作用机制提供资料.方法 用5、10、20 mmol/L的五氧化二钒(V2O5)体外培养大鼠神经元细胞染毒,用原位末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡的程度;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测Cyt-c、Caspase-9、Caspase-3蛋白表达.结果 TUNEL检测结果显示,在细胞核中可以见到凋亡小体,随着染毒剂量增高凋亡小体的细胞数逐渐增多.与对照组比较,0、20 mmol/L染毒组凋亡指数明显增高,差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01).Western blot法检测结果显示,与对照组比较,5 mmol/L染毒组的Cyt-c、caspase-3蛋白表达明显升高,差异有统计学意义(P＜0.05); 10、20 mmol/L染毒组的Cyt-c、caspase-9、caspase-3蛋白表达明显升高,差异有统计学意义(P＜0.01).神经细胞凋亡指数AI与Cyt-c、caspase-9、caspase-3呈正相关(r=0.954,P＜0.01;r=0.938,P＜0.0;r=0.943,P＜0.01).结论 五价钒能诱导神经细胞凋亡,Cyt-c、caspase-9及caspase-3蛋白表达在五价钒致神经细胞凋亡的过程中发挥了重要的调控作用.
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RNA干扰caspase-3基因对染铝小鼠神经行为的影响
目的 研究RNA干扰caspase-3基因对染铝小鼠神经行为的影响.方法 取健康3月龄雄性昆明种小鼠,按体重随机分为4组:空白对照组(给予生理盐水4 μl)、染铝组(给予0.5%AlCl3·6H2O4μ1)、Al+空载体组(给予0.5%AlCl3·6H2O 3 μl+对照siRNA表达载体1 μl)、Al+RNAi组(给予0.5%AlCl3·6H2O 3μl+目的 siRNA表达载体1 μl),侧脑室注射连续染毒5 d,采用Morris水迷宫试验、旷场试验、跳台试验检测小鼠神经行为改变,电子显微镜观察小鼠海马病理改变,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测caspase-3基因表达量.结果 与空白对照组[分别为(279.00±17.17)s、1.13±0.35]相比,染铝组的潜伏期(LT)[(44.67±10.60)s]明显缩短,错误次数(3.63±0.52)明显增加,Al+空载体组LT[(68.00±14.70)s]明显缩短,差异均有统计学意义(P<0.05);Al+RNAi组LT[(239.50±19.36)s]比染铝组明显延长,错误次数明显减少,差异均有统计学意义(P<0.05).与空白对照组相比,染铝组逃避潜伏期明显延长,原平台象限停留时间明显缩短,Al+空载体组逃避潜伏期明显延长,Al+RNAi组逃避潜伏期较染铝组明显延长,差异均有统计学意义(P<0.05).与空白对照组相比,染铝组和Al+空载体组小鼠中央格停留时间明显延长,直立次数、修饰次数明显减少,差异均有统计学意义(P<0.05);Al+RNAi组小鼠中央格停留时间较染铝组明显缩短,跨格次数、直立次数、修饰次数较染铝组明显增加,差异均有统计学意义(P＜0.05).空白对照组海马细胞出现轻微改变,染铝组和Al+空载体组海马细胞改变明显,Al+RNAi组海马细胞的病理形态变化减少.空白对照组海马CA3区神经细胞层次较为清楚,基本无变性损伤现象发生;染铝组和Al+空载体组小鼠CA3区细胞数量明显减少,排列不规则,神经元尼氏体着色较空白对照组浅;RNA干扰后,CA3区神经细胞数量明显增加,排列较规则,神经元尼氏体着色逐渐加深.染铝组和Al+空载体组的caspase表达量(分别为2.24±0.57、2.28±0.33)较空白对照组(1.00±0.00)明显增加,Al+RNAi组的的caspase-3表达量(0.44±0.08)较空白对照组和染铝组明显降低,差异均有统计学意议(P＜0.05).结论 铝可以引起小鼠学习和记忆能力障碍,活跃程度及探索能力下降,而RNAi技术能够在一定程度上减轻该毒性作用.
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百草枯中毒大鼠肺组织线粒体中电压依赖性阴离子通路及caspase-3、8、9的变化
目的 研究不同浓度百草枯(paraquat,PQ)染毒对大鼠肺组织上的线粒体线电压依赖性阴离子通路(voltage-dependent anion channel,VDAC)和caspase家族表达的影响,探讨急性百草枯中毒急性肺损伤的可能机制.方法 选取成年健康Wister大鼠200只,雌雄各半,随机分为对照组及染毒组.其中对照组100只,用1ml生理盐水一次性灌胃;染毒组100只,将PQ按50 mg/kg用生理盐水稀释到1ml,一次性灌胃染毒.分别于灌生理盐水及灌药后1、24、72、120、168 h各取20只大鼠,麻醉下解剖大鼠留取肺组织标本,分离提取线粒体并测定其VDAC及caspase-3、8、9的含量.结果 染毒后的大鼠VDAC及caspase-3、8、9的表达明显高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.001);染毒后1、24、72、120、168 h可见大鼠肺泡毛细血管内皮细胞、肺泡上皮细胞和肺间质的急性弥漫性损害,广泛肺间质炎性细胞浸润,肺泡结构紊乱,成纤维细胞明显增多等改变.结论 PQ中毒可上调大鼠肺组织线粒体VDAC及caspase-3、8、9的表达,诱导大鼠急性肺损伤的过程.
关键词： 百草枯 急性肺损伤 caspase类 线粒体电压依赖性阴离子通路 -
骨髓增生异常综合征富集造血祖细胞半胱天冬酶活性检测及意义
目的了解骨髓增生异常综合征(MDS)患者不同阶段骨髓造血祖细胞凋亡的变化及半胱天冬酶caspase3、 caspase9的作用.方法应用负筛选法纯化MDS患者骨髓造血祖细胞(包括CD34+和CD34-细胞),通过Annexin Ⅴ方法检测其凋亡,同时应用分光光度法测定细胞内caspase3、caspase9的活性.结果①MDS-RA组12例,凋亡率为39.5%;RAEB组10例,凋亡率为31.0%,两组凋亡率均明显高于对照组(P<0.01).RAEB-t/AML组12例,凋亡率为18.8%,与对照组相比,差异无显著性.②MDS-RA组caspase3活性较正常对照升高约45倍(P<0.01), caspase9的活性较正常对照升高约20倍(P<0.01).RAEB组,caspase3活性较正常对照升高约14倍(P<0.01), caspase9的活性较正常对照升高2倍余(P<0.01).RAEB-t/AML组,caspase3活性稍高于正常对照(无统计学意义), caspase9的活性与正常对照相比,差异无显著性.③RAEB组中有3例终转为急性髓系白血病(AML), 其凋亡率、caspase3和caspase9的平均吸光度值均相应下降.结论 MDS患者骨髓造血祖细胞在疾病不同阶段凋亡率是不同的,caspase3、caspase9活性升高,可能是造成MDS骨髓造血祖细胞过度凋亡的重要原因,caspase9活性下降可能是MDS发展过程中骨髓造血祖细胞由过度凋亡转为凋亡"逃逸"原因之一,caspase9不被活化,就不能激活caspase3,从而导致凋亡抑制.
