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大肠杆菌β-半乳糖苷酶EA、ED融合蛋白的表达
大肠杆菌β-半乳糖苷酶(E.C.3.2.1.23)是由四个相同亚基组成的四聚体,相对分子质量(Mr)为540000,通过溴化氰裂解或基因重组技术可得到一系列无酶活性的突变肽段,其中有些突变体在体外能重新聚合成全酶活性的四聚体,这一现象被称为α-互补[1].β-半乳糖苷酶的这种α-互补性已被用于分子生物学、蛋白质与蛋白质相互作用的监控、克隆酶供体免疫分析技术(CEDIA)、表达免疫分析等[2,3].通常具有α-互补活性缺失大部分C端氨基酸的小片段突变体如CNBr2被称为α-供体或酶供体(ED);而缺失N端约40个氨基酸的大片段突变体如M15蛋白被称为α-受体或酶受体(EA).为了进一步研究β-半乳糖苷酶的α-互补特性并促进其应用,我们通过DNA重组技术构建了一对编码β-半乳糖苷酶突变体EA、ED的质粒,并以融合蛋白的方式进行表达制备.
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类风湿关节炎患者血清中Ⅱ型胶原片段及其意义的探讨
目的 观察类风湿关节炎(RA)患者血清中Ⅱ型胶原(CⅡ)抗体片段随病情发展的变化情况.方法 采用酶联免疫吸附试验(ELISA)选取抗CⅡ抗体阳性患者,用免疫印迹方法检测其CⅡ抗体片段阳性情况.结果 112例RA患者及120名健康对照人群中CⅡ抗体阳性率分别为19.6%和1.67%,22例CⅡ抗体阳性患者中20例可观测到阳性片段,其中常见的特异位点抗体为CB10,CB11及D片段,其阳性率分别为45.4%,54.5%和45.4%.结论 CB10,CB11及D片段出现与疾病严重程度有关.
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22F型肺炎球菌荚膜多糖的活化及其多糖蛋白结合物的免疫原性
目的 用不同活化剂进行22F型肺炎球菌荚膜多糖(type 22F streptococcus pneumoniae capsular polysaccharide)的活化,并探讨其多糖蛋白结合物的免疫原性.方法 分别用溴化氰(cyanogen bromide,CNBr)和1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸酯(1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate,CDAP)作为22F型肺炎球菌荚膜多糖的活化剂,1,6-己二酰肼(1,6-adipic acid dihydrazide,ADH)作为链接剂,制备22F型肺炎荚膜多糖衍生物(3批Pn22Fps-ADH1和3批Pn22Fps-ADH2);在碳二亚胺[N-(3-Dimethylaminopropyl)-N’-ethylearbodiimide hydroehloride,EDAC]的作用下,将衍生物与破伤风类毒素(tetanus toxoid,TT)共价结合,经凝胶过滤柱层析纯化,得到22F型肺炎链球菌荚膜多糖蛋白结合物(3批Pn22Fps-TT1和3批Pn22Fps-TT2);并对其生化指标、血清学特异性、免疫原性及异常毒性进行检测.结果 衍生物Pn22Fps-ADH2的衍生率及回收率均略高于Pn22Fps-ADH1;结合物Pn22Fps-TT2的生化指标检测结果相对Pn22Fps-TT1较好;结合物Pn22Fps-TT1和Pn22Fps-TT2均可与22F型肺炎球菌诊断血清特异性结合;结合物Pn22Fps-TT1和Pn22Fps-TT2均具有良好的免疫原性;无异常毒性.结论 CNBr和CDAP均可作为22F型肺炎球菌荚膜多糖活化剂,经活化和结合反应,其抗原位点得到较好保留,但CDAP作为结合疫苗多糖的活化试剂效果更佳.
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血小板凝聚抑制剂阿那格雷的合成
血小板凝聚抑制剂阿那格雷，化学名6，7-二氯-1，2，3，5-四氢咪唑并[2,1-b]喹唑啉-2(3H)-酮(商品名：Agrylin，1)，由Roberts Pharmaceuticals公司开发，1997年获准在美国上市。该药选择性强，无白细胞减少、贫血及可疑致白血病的严重副作用。目前用于治疗与血小板增多有关的各种病症，是第一个被批准用于特发性血小板增多症的药物。 文献[1]以间氯苯胺为起始原料，经2～8制备1，此路线在由8制备1时需用毒性较大的溴化氰，存在安全问题。本文设计由5经9～10，进而结合文献[2]合成1(图1)。本法使用常规试剂，条件较温和，取得满意结果。
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溴化氰切割融合蛋白条件的研究
目的 研究不同因素对溴化氰切割融合蛋白的影响.方法 将含有pThioHisA-G13重组质粒的BL21工程茵,经IPTG诱导后,超声破碎,分离并溶解包涵体,再选择不同量的溴化氰、酸浓度及不同溶剂等条件进行溴化氰切割试验,Tricine-SDS-PAGE检测切割效果.结果 溴化氰的量,酸浓度及不同溶剂对溴化氰切割包涵体的效果均有影响.结论 高效率的切割需要在酸性条件下进行;以尿素作为促溶剂比70%的甲酸更有利于小肽的切割.
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两种pH值条件下CNBr活化Sepharose 4B偶联DSA方法的比较研究
目的研究碱性、中性两种条件下CNBr活化Sepharose 4B偶联欧蔓陀罗凝集素(DSA)的效果.方法在两种偶联条件下,通过改变CNBr用量、活化时间以及温度等条件,观察DSA的偶联率指标.结果碱性条件下,活化15 min即使增加CNBr用量至300mg/ml凝胶,固定化凝集素偶联率没有提高,DSA偶联率较低,在29.1%～50.9%之间;中性条件下,CNBr用量仅为碱性条件下的20%,活化温度控制在-10～-20℃可能获得较好的活化效果,DSA偶联率在78.8%～80.9%之间.结论中性条件下CNBr活化Sepharose 4B偶联DSA,实验易于控制,DSA偶联率比较稳定,实验重复性好于碱性条件下的结果,且可获较高偶联率的DSA-Sephrose 4B.
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人血清中Hib荚膜多糖抗体定量的ELISA方法建立及初步验证
目的 比较两种不同活化方法制备的酪胺化Hib荚膜多糖(PRP-Ty)的特性,分别作为包被抗原建立测定人血清中Hib荚膜多糖特异抗体含量的ELISA方法.比较并确定包被抗原,对建立的ELISA方法进行初步验证.方法 分别用CNBr和CDAP作为活化剂制备PRP-Ty,经Sepharose CL-4B层析分析相对分子质量分布范围,并确定适宜PRP-Ty抗原包被浓度的间接ELISA方法,以人Hib荚膜多糖IgG抗体定量标准品作为阳性标准,通过四参数非线性拟合计算人血清Hib荚膜多糖IgG抗体含量.结果 CNBr活化法制备的酪胺化Hib荚膜多糖(PRP-TyCNBr)较天然Hib荚膜多糖相对分子质量向小相对分子质量方向偏移,而CDAP活化法制备的酪胺化Hib荚膜多糖( PRP-TyCDAP)较天然Hib荚膜多糖相对分子质量分布无显著变化；两种PRP-Ty在0.65～2.00 μg/mL的包被浓度范围内均有良好的包被活性,方法的灵敏度均达到0.02 μg/mL IgG抗体检测水平.结论 PRP-TyCDAP作为包被物的ELISA测定方法可以更加真实可靠地反映人血清IgG抗体水平.
关键词： b型流感嗜血杆菌(Hib)荚膜多糖 酪胺 溴化氰 CDAP ELISA
