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问号钩端螺旋体rLTB/rCTB-LipL32/1免疫保护作用及野生株LipL32基因表达和患者抗体检测
目的构建LTB-LipL32/1和CTB-LipL32/1融合基因原核表达系统并鉴定其表达产物的免疫和佐剂活性及保护作用,了解问号钩端螺旋体(简称钩体)野生株LipL32基因携带、表达及钩体病人血清LipL32基因产物抗体产生频率. 方法采用常规分子生物学技术构建LTB-LipL32/1和CTB-LipL32/1融合基因及其原核表达系统.采用SDS-PAGE检测目的重组蛋白rLTB-LipL32/1及rCTB-LipL32/1表达情况.分别采用Western blot和GM1-ELISA检测rLTB-LipL32/1及rCTB-LipL32/1的免疫反应性和佐剂活性.采用PCR和MAT分别检测97株问号钩体野生株LipL32基因及其表达情况.采用ELISA检测228例钩体病人血清LipL32基因产物的抗体.采用豚鼠保护试验检测重组蛋白的免疫保护作用. 结果与报道的相关序列比较,LTB-LipL32/1和CTB-LipL32/1融合基因核苷酸序列相似性分别为99.12%～99.71%和98.54%～99.42%,氨基酸序列相似性分别为97.58%～99.63%和96.77%～99.63%.rLTB-LipL32/1和rCTB-LipL32/1表达产量均约为细菌总蛋白的10%,并主要以包涵体形式存在.rLTB-LipL32/1和rCTB-LipL32/1均分别能与LipL32/1兔抗血清和牛GM1结合.97.9%(95/97)问号钩体野生株含有LipL32基因,95.9%(93/97)问号钩体野生株与rLipL32/1和rLipL32/2兔抗血清的MAT结果阳性.97.4%(222/228)和94.7%(216/228)的病人血清rLipL32/1和rLipL32/2抗体阳性.rLTB-LipL32/1、rCTB-LipL32/1和rLipL32/1豚鼠保护率分别为75.0%、75.0%～87.5%、50.0%～62.5%. 结论成功构建了LTB-LipL32/1和CTB-LipL32/1融合基因及其原核表达系统.rLTB-LipL32/1和rCTB-LipL32/1融合蛋白有良好的抗原性和佐剂活性及一定的免疫保护作用,具有成为问号钩体属特异性疫苗的良好前景.LipL32/1是不同问号钩体血清群中广泛存在、序列保守、高频率表达的基因.
