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血凝素蛋白裂解位点对H5亚型禽流感病毒侵入细胞的影响
目的 通过RT-PCR反应获得了H5N1亚型禽流感病毒完整的血凝素基因(HA)并克隆到真核表达载体pcDNA3上,通过转染293T细胞进行了瞬时表达验证.方法 采用PCR定点突变技术,将其HA基因裂解位点的氨基酸组成由RKKR↓GLF突变为RSSR ↓ GLF,使其具有低致病性AIV的分子特征,并构建了表达突变后HA基因的真核表达载体pcDNA-Hm.将pcDNA-H5和pcDNA-Hm分别与MuLV假病毒构建体系的两种质粒pHIT60和pHIT111共转染转化了SV40大T抗原的人胚肾细胞293T后,收集转染细胞上清,通过Western-blot和细胞感染性实验来研究假病毒的特性.用缺乏囊膜蛋白和已经证实可以形成MuLV假病毒的水泡性口炎病毒糖蛋白G作为对照.结果 转染后形成假病毒进行裂解后进行Western-blot证明两种HA蛋白都能够整合到各自的假病毒颗粒表面,野生型的HA可以检测到三条带,分别与HA0、HA1和HA2大小相符,而突变后的HAm则仅能检测到一条带,与HA前体大小相符,说明其失去了裂解活性.通过感染293T、COS-7和NIH3T3三种不同的靶细胞后发现野生型的HA所形成的假病毒MuLV-H5具有感染性和泛嗜性,而突变后的HA所形成的假病毒则失去了感染性.结论 可以得出HA蛋白裂解位点的氨基酸组成不仅对H5亚型禽流感病毒的致病性有影响,对禽流感病毒侵入细胞也具有至关重要的作用.
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猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白介导的E蛋白假型鼠白血病病毒的构建
利用RT-PCR法扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5和ORF6基因,分别构建pcDNA-ORF5、pcD-NA-ORF5/6和pcDNA-ORF5-ORF6真核表达载体,磷酸钙共沉淀法瞬时转染293T细胞,48h后收集细胞,流式细胞仪检测,结果表明:PRRSV ORF5基因编码囊膜蛋白(E蛋白)能在在293T细胞表面表达,而由共表达M蛋白(ORF6基因编码的基质蛋白)介导的E蛋白的表达量比单独E蛋白表达量高,串联表达与单独E蛋白相比较低.将pcDNA-ORF5、pcDNA-ORF5/6和pcDNA-ORF5-ORF6分别与MuLV假病毒构建体系的两种骨架载体pHIT60(包括MuLV的结构蛋白基因,即gag和pol)和pHITlll(为MuLV的基因组,还包括一个报告基因LacZ)瞬时共转染293T细胞,48h后收集假病毒上清,超速离心后通过Western blot证实E蛋白能够在此假病毒颗粒表面表达,证明E蛋白已整合到此假病毒粒子表面.将整合PRRSVE蛋白的假病毒粒子分别感染Marc-145和PAM宿主靶细胞,均能检测到LacZ基因的表达,结果表明:所构建的假病毒粒子具有感染性,且由M蛋白介导的MuLv-E/M感染性比MuLV-E假病毒感染性高.
关键词: 假病毒 鼠白血病病毒 猪繁殖与呼吸综合征病毒 ORF5/6基因 -
高滴度感染力H5N1亚型禽流感病毒假病毒颗粒的制备
利用一个瞬时共转染系统,将H5N1亚型禽流感病毒的血凝素(Hemagglutinin,HA)蛋白与神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)蛋白整合到鼠白血病病毒假病毒颗粒表面,包装成表达HA与NA的假病毒颗粒,通过透射电子显微镜形态学观察、感染滴度分析、血凝试验和中和试验研究其生物学特性.研究获得了高滴度感染力的H5N1假病毒颗粒(H5N1 Pseudotyped particle,H5N1Pp),H5N1Pp的感染力滴度为108 Pp/mL,形态、血凝活性及中和特性均与野生H5N1病毒相似,结果为H5N1病毒受体、HA与NA的功能、中和抗体、抗病毒药物开发研究的开展建立了平台.
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c-abl的生物学特性及致白血病机制
-abl基因是Abelson小鼠白血病病毒癌基因v-abl在人类细胞中的同源物,位于9号染色体,编码相对分子质量为145×103的蛋白质,具有非受体酪氨酸激酶活性.c-abl在进化中相当保守,其直向同源基因(orthologue)存在于果蝇和秀丽线虫的基因组中.c-abl在人体内广泛表达,以脾脏、胸腺、睾丸中多.目前已发现c-abl有3种转化形式:v-abl、bcrabl、tel-abl,分别导致Abelson小鼠白血病、慢性粒细胞白血病、急性髓系和淋巴细胞白血病.c-abl基因剔除小鼠表现为新生个体高死亡率,T、B淋巴细胞发生障碍,生育力下降,脾脏和骨骼发育缺陷[1].近来对c-abl的研究集中于阐明其激酶活性的调控,生理功能及致白血病机制,并已取得了重要进展.
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前病毒插入诱变与白血病发生的研究进展
慢性白血病病毒包括禽白血病增生症病毒、猫白血病病毒、牛白血病病毒、长臂猿白血病病毒和小鼠白血病病毒等,它们的基因组结构完整,具有病毒复制能力,但是序列内不含有癌基因,这是此类病毒的共同特点,其中以小鼠白血病病毒具代表性。小鼠白血病病毒感染动物后可产生不同类型白血病,潜伏期较长(3~4个月)。小鼠白血病病毒诱发白血病机制较复杂,是一个由多因子参加、多阶段发展的过程。本文就小鼠白血病病毒前病毒插入诱发的淋巴细胞白血病和粒细胞白血病中,原癌基因激活及其作用机制进行综述。
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艾滋病动物模型的建立方法及中药干预研究
中医药防治艾滋病实验研究至关重要的环节是艾滋病动物模型的建立,其建立难点在于HIV病毒危害程度高,缺乏佳动物模型.中医实验界以逆转录病毒为突破口,应用同属逆转录病毒科的鼠白血病病毒替代HIV建立艾滋病动物模型.探讨鼠白血病病毒致小鼠艾滋病模型建立的可行性,综述中药干预鼠白血病病毒致小鼠艾滋病的实验研究进展,为中医药治疗艾滋病提供参考.
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Fr.MuLV小鼠红白血病模型的建立及叠氮胸苷抗病毒作用的研究
目的 应用Friend 鼠白血病病毒(Friend murine leukemia virus,Fr.MuLV)建立小鼠红白血病模型,并在此模型上观察抗逆转录病毒药物叠氮胸苷(Zidovudine,AZT)的治疗作用.方法 用Fr.MuLV感染BALB/c小鼠.以RT-PCR 法测定脾脏病毒载量;血常规分析白细胞(WBC)、血红蛋白(Hbg)及血小板(PLT)变化;镜检计数外周血及骨髓有核细胞.结果 与正常对照组相比,模型组小鼠脾脏病毒载量、WBC和Hbg明显升高;外周血及骨髓中红系和非红系均出现大量原始和幼稚细胞,骨髓中非红系原始细胞(NEC)计数≥ 0.30,有核红细胞≥ 0.50;AZT治疗组上述指标明显改善.结论 用Fr.MuLV感染BALB/c小鼠成功建立小鼠红白血病模型,AZT在此模型上显示出良好的抗病毒作用.
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Bmi-1基因与PI3K/AKT信号通路关系的研究进展
B细胞特异单克隆鼠白血病病毒整合位点基因(B cell-specific MLV integration site-1,Bmi-1),又被称为干细胞更新因子,是荷兰癌症中心于1991年在寻找能与癌基因c--mTyc相互协同引起转基因小鼠患上淋巴瘤的实验中发现的[1].它的异常表达与人类多种肿瘤的发生、发展过程密切相关[2-4].Ink4a/Aff信号通路一直被认为是Bmi-1基因调控肿瘤细胞的经典通路[5-7].
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整合禽流感病毒血凝素糖蛋白的假型鼠白血病病毒
本研究通过一个瞬时转染系统将H5N1亚型鹅源禽流感病毒囊膜表面的血凝素(HA)糖蛋白整合到鼠白血病病毒(MuLV)颗粒表面并进行了感染性测定.将包含HA基因的真核表达质粒pcDNA-HA与MuLV假病毒构建体系的两种质粒pHIT60(包括MuLV的结构蛋白基因,即gag和pol)和pHIT111(为MuLV的基因组,还包括一个报告基因LacZ)瞬时共转染转化了SV40大T抗原的人胚肾细胞293T,48小时后收集假病毒上清进行了一系列鉴定.将假病毒上清超速离心后用抗H5亚型禽流感病毒的多抗通过Western-blot证实HA 蛋白能够在此假病毒颗粒表面表达,表明HA能够整合到此病毒粒子表面.通过感染293T、COS-7和NIH3T3三种不同的靶细胞,均能检测到LacZ基因的表达,证实所构建的假病毒粒子具有感染性.本研究成功构建了具有感染性的MuLV-HA假病毒,为研究鹅源禽流感病毒侵入细胞的机理及其组织嗜性的变异提供一种新方法.
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Menin在胃癌细胞中的表达
我们选取5株不同分化程度的人胃癌细胞,检测Menin的表达,现报道如下.一、材料与方法1.材料和细胞培养:Trizol、逆转录(RT)试剂盒、聚合酶链反应(PCR)试剂盒、荧光二抗、辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗、Menin和甘油醛-3-磷酸脱氢酶( GAPDH)抗体购自美国Santa公司.人胃癌细胞AGS、BGC-823、SGC-7901、MKN-28和人胃黏膜上皮细胞GES-1均为本实验室保存,细胞常规培养并进行后续实验.2.RT-PCR检测:采用Trizol试剂,按说明书提取细胞总RNA,应用鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶将总RNA逆转录成cDNA并进行扩增和琼脂糖凝胶电泳分离,用Tanon-2500凝胶成像进行检测.
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小鼠白血病毒致白血病机制的研究进展
目的:在国外常用的小鼠白血病病毒(MuLV)有:Gross-MuLV、Graffi MuL V、 Moloney-MuLV(M-MuLV)、Rauscher-MuLV和Abelson MuLV(Abl-MuLV)等;国内分离的有T638-MuLV、L6565-MuLV和SRS-MuLV,可诱发淋巴细胞白血病、粒细胞白血病、红白血病和淋巴瘤.迄今仅证明Abl-MuLV具有急性转化作用的特点,注射小鼠后能在3~4周诱发B淋巴细胞白血病.
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Oncogene:长链非编码RNA与免疫细胞癌变研究获进展
Abelson鼠白血病病毒(A-MuLV)是一种可以诱导小鼠淋巴细胞癌变的逆转录病毒,v-Abl是A-MuLV的癌基因。Bcr-Abl癌基因是由位于人类9号染色体的c-Abl基因和22号染色体的Bcr基因断裂易位融合而成,编码的Bcr-Abl融合蛋白可以诱发人的慢性粒细胞白血病(CML)和急性淋巴细胞白血病(ALL)。
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在肿瘤干细胞中的研究进展
Bmi1是荷兰癌症中心于1991年在转基因鼠感染Moloney鼠白血病病毒过程中通过逆转录病毒插入突变发现的[1],1993年,ALKEMA等[2]首次将其从人白血病细胞中分离出来.作为多梳基因家族成员之一,Bmi1在细胞的增殖和干细胞自我更新、分化调节中发挥重要作用[3-4].目前,已有多项研究报道Bmi1在多种肿瘤如白血病、乳腺癌、肺癌、胃癌等中高表达[5-7],并且与肿瘤的转移和扩散相关.传统的肿瘤治疗方法是利用手术、放化疗等方法尽量清除已存在的肿瘤细胞,但术后仍有复发和转移,近年来肿瘤干细胞理论的提出,为恶性肿瘤的根治提供了新的思路[8].
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L6565小鼠白血病病毒诱发小鼠白血病
关键词: 鼠白血病病毒 -
XMRV感染与前列腺癌
前列腺癌是男性中常见的肿瘤之一,生活方式、遗传因素、病毒感染等都与前列腺癌的的发生和发展密切相关.嗜异性鼠白血病病毒相关病毒(Xenotropic murine leukemia virus-related virus,XMRV)是Anatoly Urisman等在RNASEL基因变异的家族性前列腺癌患者组织中发现的一种新逆转录病毒.我们将围绕XMRV在不同地区的前列腺癌患者中的流行情况以及可能的原因进行论述.