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siRNA干扰跨膜转运蛋白21的表达对KO小鼠胚胎成纤维细胞γ分泌酶活性的影响
目的 探讨跨膜转运蛋白21(TMP 21)对γ分泌酶活性的影响.方法 将淀粉样前体蛋白基因缺陷型KO小鼠胚胎成纤维细胞[MEF(KO)]分为转染组(T)和对照组(C),转染组转染载有TMP 21小分子干扰RNA(siRNA)的质粒,对照组转染空质粒.每组均制备包含细胞全膜蛋白的样品(T1、C1),经CHAPSO进一步溶解后超速离心制备所得纯化全膜蛋白样品(T2、C2),用γ分泌酶组分早老蛋白1(PS-1)特异性抗体免疫沉降C2或T2后获得的γ分泌酶样品(IPT2、IPC2).蛋白质印迹法检测各类样品中γ分泌酶重要组分TMP 21、PS-1和Nicastrin(NCT)蛋白表达量;应用ELISA法检测β淀粉样肽40和β淀粉样肽42的生成总量.结果 蛋白质印迹法检测显示,TMP 21蛋白表达量在转染组样品IPT2中为5294±247 ng/ml,在对照组样品IPC2中为19110±579 ng/ml,组间差异有统计学意义(P<0.05);各类样品中PS-1与NCT蛋白表达量无明显变化;TMP21可与PS-1共沉降.ELISA法检测显示,转染组样品IPT2与饱和浓度底物C99反应生成的β淀粉样肽40和β淀粉样肽42总量为348±18 pg/ml,对照组样品IPC2为与饱和浓度底物C99反应生成的β淀粉样肽40和β淀粉样肽42总量为342±18pg/ml,组间差异有统计学意义(P<0.01).结论 TMP 21可能为γ分泌酶的组分之一.在TMP21蛋白低表达状态下γ,分泌酶活性升高,提示TMP 21为γ分泌酶的负调控因子之一.
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α7尼古丁受体基因抑制对SH-SY5Y细胞β淀粉样蛋白生成的影响
目的 通过RNA干扰技术抑制神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞)中α7神经型尼古丁乙酰胆碱受体(nAChR)的基因表达,以了解α7 nAChR对β淀粉样蛋白(Aβ)的影响,进一步探讨阿尔茨海默病的发病机制.方法 SH-SY5Y细胞转染α7 nAChR的小干扰RNA(siRNA),用real-time PCR法和蛋白免疫印迹法分别测定细胞中α7 nAChR、β分泌酶两个亚型(BACE1和BACE2)在mRNA和蛋白表达水平的变化；用双抗体夹心酶联免疫吸附法测定Aβ1-42含量的变化.结果 转染α7 nAChR siRNA后,与对照组相比,α7 nAChR mRNA及蛋白表达水平分别降低了84％和79％(P＜0.01)；BACE1 mRNA及蛋白表达水平分别升高了527％和71％(P＜0.01)；BACE2 mRNA及蛋白表达水平分别降低了58％和75％ (P＜0.01)；Aβ1-42含量升高了208％(P＜0.01).结论 α7 nAChR基因表达抑制后Aβ含量明显升高,其机制可能与BACE1表达上升和BACE2表达抑制有关,这种改变可能与阿尔茨海默病的发病有一定的关系.
关键词： 阿尔茨海默病 淀粉样β蛋白前体 淀粉样前体蛋白分泌酶类 受体 胆碱能 -
阿尔茨海默病γ分泌酶相关调控通路的研究进展
随着我国逐渐步入老龄化社会,以记忆力减退及认知功能障碍为主要表现,且与年龄增长密切相关的阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)已成为严重影响老年人晚年生活质量的主要疾病.AD的发病机制目前尚不十分清楚,医学界关于其发病机制的假说较多,其中β淀粉样蛋白(β-amyloid protein,Aβ)级联学说的研究较为成熟.近年来研究已发现,γ分泌酶是催化Aβ生成的终末阶段,在Aβ产生中起着非常重要的作用,决定了产生的Aβ1-42在其中所占的比例,与AD的发生密切相关[1].关于γ分泌酶及相关调控通路的研究,已成为近年来探索AD发病机制及其防治方面关注的一个热点.
关键词： 阿尔茨海默病 淀粉样β蛋白 淀粉样前体蛋白分泌酶类 早老素类 转录因子AP-1 -
前咽缺陷蛋白-1在APP/PS1转基因阿尔茨海默病小鼠模型中枢神经系统的分布及表达
目的 研究y-分泌酶组件蛋白APH-1(anterior pharynx defective 1,APH-1)在成年APP/PS1双转基因痴呆小鼠中枢神经系统(central nervous system,CNS)中的分布及表达,以及在阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)模型鼠和野生型小鼠脑中的表达差异,以进一步明确APH-1与AD的关系.方法 对APP/PS1双转基因AD模型种鼠交配后产下的子代进行基因分型,用免疫组化方法检测APH-1在成年APP/PS1双转基因痴呆模型小鼠CNS内的分布及表达,以及比较APH-1在出生后1d、7d、21 d、120 d的痴呆小鼠及同窝野生型小鼠脑内的表达和分布情况.结果 APH-1广泛分布于成年痴呆小鼠CNS的各区域,包括大脑皮质、海马、嗅脑、丘脑、纹状体、尾状核、中缝大核、小脑、脑干和脊髓等；出生1 dAD模型鼠与同窝野生型小鼠大脑皮质内APH-1均有高水平表达,而出生7d、21d表达水平较低,且成年小鼠脑中其表达量有所回升；各时间点痴呆小鼠脑内APH-1免疫阳性反应都比同窝野生型小鼠显著增强(P＜0.05).结论 APH-1在痴呆小鼠的CNS中广泛分布,但不同脑区分布和表达存在差异；且痴呆小鼠和正常野生型小鼠脑内APH-1分布和表达有区别,这些差异可能与AD的发生相关.
关键词： 淀粉样前体蛋白分泌酶类 中枢神经系统 阿尔茨海默病 -
卵巢上皮性癌组织中Notch1、Jagged1和NICD蛋白表达的意义及癌细胞中γ-分泌酶活性的初步探讨
目的 了解Notch1、Notch配体(Jagged1)及Notch细胞内区(NICD)在卵巢上皮性癌(卵巢癌)组织中的表达及其临床意义;初步探讨卵巢癌细胞系SKOV3细胞中γ-分泌酶活性,及γ-分泌酶抑制剂——氮-[氮-(3,5-二氟苯乙酰基)-L-丙氨酰]-S-苯基甘氨酸丁酯(DAPT)对SKOV3细胞γ-分泌酶活性的影响.方法 (1)选取2004年3月到2007年7月于北京大学第一医院住院并接受治疗的卵巢癌患者共43例,选取2009年10月到2012年5月于本院因卵巢良性上皮性肿瘤行卵巢肿物剥除或附件切除的11例患者作为对照,应用免疫组化法检测卵巢癌及卵巢良性上皮性肿瘤组织中Notch1、Jagged1及NICD蛋白的表达,分析其与卵巢癌患者临床病理指标的关系.(2)体外培养卵巢癌细胞系SKOV3、永生化卵巢表面上皮细胞系T29细胞,采用基于Gal4-VP 16/UAS系统和双荧光素酶报告基因系统的检测方法对SKOV3和T29细胞中的γ-分泌酶活性进行测定,并测定加入50 μmol/L的DAPT后γ-分泌酶活性的变化.结果 (1) Notch1蛋白在卵巢癌组织中的免疫组化综合评分为(6.7±2.2)分,与卵巢良性上皮性肿瘤组织的(5.4±2.7)分比较,差异无统计学意义(P=0.153);Jagged1及NICD蛋白在卵巢癌组织中的综合评分分别为(5.3±2.4)、(5.3±2.3)分,显著高于卵巢良性上皮性肿瘤组织的(1.6±1.4)、(3.1±1.7)分(P＜0.01).Notch1、Jagged1及NICD蛋白的表达与卵巢癌患者的年龄、家族史、腹水、血清CA125水平、肿瘤长径、手术病理分期、病理分化程度及病理类型均无关(P均＞0.05).Notch1、Jagged1和NICD蛋白表达的强弱与卵巢癌患者的5年生存率及中位生存时间均无关(P均＞0.05),Notch1、Jagged1、NICD蛋白(+++)表达与其(+)～(++)表达的卵巢癌患者的死亡风险的危险度比(HR)分别为0.771、1.648和1.316(P均＞0.05).(2) DAPT处理前,SKOV3细胞的γ-分泌酶活性为(100.0±5.3)％,明显高于T29细胞的(12.2±1.4)％(P=0.019).DAPT(50 μmol/L)处理后,SKOV3细胞的γ-分泌酶活性降至(6.6±0.8)％,DAPT处理前、后比较,差异有统计学意义(P=0.001).结论 Notch1信号传导通路中的Jagged1和NICD蛋白可能在卵巢癌的发生中发挥作用.卵巢癌细胞的γ-分泌酶活性高于卵巢上皮细胞,γ-分泌酶可能成为治疗卵巢癌的靶点.
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轻度认知功能障碍和阿尔茨海默病患者血小板α和β分泌酶活性的变化
目的 研究轻度认知功能障碍(MCI)和阿尔茨海默病(AD)患者血小板α和β分泌酶活性及α分泌酶的产物sAPPα含量的变化.方法 对48例其他疾病老年对照者、42例MCI患者及40例AD患者分别进行神经功能评定,用荧光法测定各组患者血小板α和β分泌酶的活性,并用Western印迹检测血小板sAPPα含量.结果 对照组、MCI组和AD组患者α分泌酶活性分别为100.0％±10.6％、78.2％±9.4％和61.8％±7.2％,MCI和AD组与对照组相比均降低,差异有统计学意义(F=22.935,P=0.001)；AD组与MCI组相比亦明显降低,差异有统计学意义.对照组、MCI组和AD组β分泌酶的活性分别为100.0％士11.2％、145.8％士12.7％和189.8％士14.2％；MCI组和AD组均较对照组升高,差异有统计学意义(F=16.368,P=0.001),AD组较MCI组高,差异有统计学意义.sAPPα的含量MCI组和AD组与对照组相比均明显降低；AD组与MCI组相比亦显著降低,差异有统计学意义.结论 MCI组和AD组患者的α分泌酶活性及其产物sAPPα均较对照组降低,β分泌酶活性升高；α和β分泌酶活性改变可能在MCI和AD的发病过程中起着一定的作用,在MCI和AD的诊断中有一定的潜在价值.
关键词： 认知障碍 阿尔茨海默病 淀粉样前体蛋白分泌酶类 -
去整合蛋白和金属蛋白酶10基因启动子区多态性与散发性阿尔茨海默病的关系
目的 探讨去整合蛋白和金属蛋白酶10(ADAM10)基因启动子区多态性与散发性阿尔茨海默病( sporadic Alzheimer's disease,SAD)的相关性.方法 采用随机数字表法抽取2000-2007年北京市宣武医院和秦皇岛市海港医院门诊10例SAD患者及10名健康对照者进行ADAM10基因启动子区测序,针对所发现的3个多态性位点,应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性的方法对315名健康对照者(对照组)及298例SAD患者(SAD组)进行基因型检测,并进行病例-对照相关性分析.结果 在ADAM10基因启动子区共发现3个多态性位点:- 279G/A( rs653765)、- 630G/T(rs514049)和- 921GAGA/-( rs33926666).其中- 921GAGA/-基因型频率[GAGA/GAGA:138(46.3％)、GAGA/-:155(52.0％)、-/-:5(1.7％)]和等位基因频率[GAGA:431(73.6％)、-:165(27.7％)]在SAD组和对照组之间差异有统计学意义(基因型:x2=34.130,P =0.000;等位基因型:x2=25.972,P =0.000),- 279G/A经ApoE分型后在不携带ApoEε4的亚组中,SAD组与对照组间的差异有统计学意义(基因型:x2=8.734,P=0.013;等位基因型:x2=5.129,P=0.024),- 279G 和- 921GAGA为SAD相对保护性的等位基因,两者之间不存在连锁不平衡关系.结论 ADAM10基因启动子区-279G/A和- 921GAGA/-多态性与SAD的发病具有一定的相关性,-279G/G基因型和-921GAGA/GAGA基因型对SAD的发病可能具有一定的保护作用.
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胰岛素信号通路磷脂酰肌醇-3激酶/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶对海马神经元β-淀粉样前体蛋白裂解酶1表达的影响
目的 通过胰岛素和磷脂酰肌醇-3激酶(PDK)抑制剂渥曼青霉素(wortmannin,WORT)对PI3K/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(PDK/Akt)信号通路的激活和抑制作用,观察PI3K/Akt信号通路对海马神经元B-淀粉样前体蛋白裂解酶1(BACE1)表达的影响.方法 40只SD大鼠随机分为空白对照组、假手术组、胰岛素组和WORT组(每组10只),海马立体定向注射胰岛素和PI3K抑制剂WORT.免疫组织化学和Western blot法检测PI3K/Akt信号传导相关蛋白以及BACE1的表达水平.结果 注射胰岛素的海马PI3K信号通路下游信号分子较对照组:Akt表达增加(0.952±0.060与0.835±0.029,t=4.9150,P=0.0001),Akt set473位点磷酸化(pAkt)水平上调(0.800±0.075与0.657±0.025,t=4.5598,P=0.0002),糖原合成激酶-3α(GSK-3α)磷酸化水平降低(0.604±0.062与0.726±0. 041,t=3.5871,P=0.0018),而成熟的BACE1及其裂解产物β分泌酶C末端(β-CTF)表达下调.WORT组的PI3K下游信号分子Akt、pAkt表达明显被抑制,磷酸化GSK-3α表达增加,同时成熟的BACE1(1.004±0.096)和β-CTF(1.031±0.048)的表达较对照组(分别0.498±0.064,0.786±0.101)上调(分别t=11.5980,P=0.0000;t=4.2194,P=0.0004).结论 胰岛素信号通路PI3K/AKt可以调节BACE1的表达和活性并参与阿尔茨海默病的发病机制.
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β-分泌酶2外显子区多态性与中国北方汉族人群散发性阿尔茨海默病相关性分析
目的 研究β-分泌酶2(BACE2)基因外显子区多态性与中国北方汉族人群散发性阿尔茨海默病(SAD)发病的相关性.方法 选取2000-2008年在首都医科大学宣武医院、北京市老年病医院、北京市十余家老人院及秦皇岛海港区社区就诊的348例SAD患者及2000-2008年首都医科大学宣武医院门诊体检及秦皇岛海港区退休人员体检的294名健康人为研究对象.应用随机数字表法选取10例SAD患者以及10名健康对照者进行BACE2外显子区测序.用微测序或者直接测序的方法对348例SAD患者及294名健康对照进行多态性分型.用SPSS 17.0统计软件包进行等位基因和基因型分布的比较及分析它们与疾病的关联性.结果 经筛查,中国北方汉族人群中的BACE2基因外显子区域附近存在3个多态性位点:分别为rs2252576C/T,rs1046210C/T和rs12149C/T.对这3个多态性位点的检测和统计分析得出:3个多态性位点的基因型和等位基因频率差异均无统计学意义.结论 BACE2外显子区域rs2252576C/T,rs1046210C/T和rs12149C/T多态性位点的等位基因和基因型频率与中国北方汉族人群SAD无关.
关键词： 阿尔茨海默病 淀粉样前体蛋白分泌酶类 基因 -
多奈哌齐治疗阿尔茨海默病对患者血小板α和β分泌酶活性的影响
目的 研究胆碱酯酶抑制剂多奈哌齐对阿尔茨海默病(AD)患者的血小板α和β分泌酶活性的影响.方法 选取2007年8月至2010年10月在河南省人民医院神经内科诊治的76例AD患者,随机数字表法分为多奈哌齐治疗组和对照治疗组,每组38例.多奈哌齐治疗组给予多奈哌齐,每晚5 mg口服；对照治疗组给予常规改善脑代谢药物.另设本院同期非痴呆疾病组40例,分别给予相应的治疗.12周后分别测定两组AD患者的AD评定量表认知分量表(ADAS-Cog)、日常生活能力评定量表(ADL)；分别测定非痴呆疾病组和两组AD患者血小板中α和β分泌酶的活性,并用Western印迹检测血小板α分泌酶的产物sAPPα的含量.结果 多奈哌齐治疗组降低ADAS-Cog评分(5.3±4.4)分,与对照治疗组的(1.7±1.6)分相比,差异有统计学意义(P＜0.01)；12周后多奈哌齐治组的ADL评分(41±7)分明显低于对照治疗组(48±6)分,差异有统计学意义(P＜0.05)；与治疗前(50±6)分相比,差异有统计学意义(P＜0.05).12周后多奈哌齐治疗组的α分泌酶活性(91％±9％)明显高于对照治疗组(64％±8％,P＜0.01),β分泌酶活性(1 19％±11％)明显低于对照治疗组(178％±17％,P＜0.01)；与治疗前相比差异均有统计学意义(均P＜0.01).对照治疗组血小板sAPPα含量(26％±8％)明显低于非痴呆疾病组(100％±12％) (P ＜0.001),多奈哌齐治疗组12周sAPPα含量(64％±14％)明显高于对照治疗组(P＜0.01).结论 多奈哌齐治疗显著提高了AD患者的认知功能和日常生活能力,表现为降低ADAS-Cog和ADL评分；多奈哌齐治疗提高了AD患者血小板α分泌酶活性并降低了β分泌酶的活性；多奈哌齐对AD患者的认知功能的改善可能与其对血小板分泌酶的活性调节有关.
关键词： 阿尔茨海默病 胆碱酯酶抑制剂 淀粉样前体蛋白分泌酶类 -
β-淀粉样蛋白前体蛋白裂解酶1相关干预策略在阿尔采末病治疗的研究进展
阿尔采末病(AD)是一种进行性的神经退行性疾病,其发病原因是脑内β淀粉样蛋白(Aβ)的聚集和沉积.Aβ是由淀粉样蛋白前体经β-分泌酶和γ-分泌酶剪切代谢生成,而β-淀粉样蛋白前体蛋白裂解酶1 (BACE1)是该过程的限速酶,抑制BACE1的活性可减少Aβ的产生,因此BACE1成为人们关注治疗AD的热门靶点.本文对近年来BACE1靶点在阿尔采末病治疗中的研究和进展进行综述.
关键词： 阿尔采末病 β淀粉样蛋白前体 淀粉样前体蛋白分泌酶类 天冬氨酸蛋白酶类 -
N-甲基-D-天冬氨酸受体抑制剂盐酸美金刚对老年性痴呆大鼠β-淀粉样前体蛋白及β分泌酶表达的影响
目的：探讨 N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体抑制剂盐酸美金刚对老年性痴呆（AD）大鼠β-淀粉样前体蛋白（APP）及β分泌酶（BACE1）表达的影响。方法30只 SD 大鼠随机数字表法分为假手术组、模型组、治疗组（盐酸美金刚组）；除假手术组外，其余两组大鼠海马注射10μg β-淀粉样蛋白（Aβ）1-40构建 AD 大鼠模型，治疗组大鼠腹腔注射10 mg·kg －1·d －1盐酸美金刚，其余两组给予等量生理盐水，连续给药14 d，并于第1、3、7、14天采用 Morris 水迷宫实验检测大鼠的空间学习记忆能力，于14 d 处死大鼠取血及海马组织。ELISA 法检测血清及海马组织中 Aβ含量，western blot 及 RT-PCR 法检测海马组织中APP 和 BACE1蛋白及 mRNA 表达量。结果与假手术组比较，模型组大鼠水迷宫潜伏期延长，Aβ含量显著提高，APP 及BACE1蛋白及 mRNA 含量显著提高，均差异有统计学意义（P ＜0．01）；与模型组比较，治疗组大鼠水迷宫潜伏期缩短，Aβ含量显著降低，APP 及 BACE1蛋白及 mRNA 含量显著下降，均差异有统计学意义（P ＜0．01）。结论盐酸美金刚能通过阻断APP 裂解，从而抑制 AD 大鼠海马组织中 Aβ沉积。
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硒对人神经母细胞瘤细胞β-淀粉样蛋白表达影响
目的 探讨亚硒酸钠对人神经母细胞瘤细胞β-淀粉样蛋白(Aβ)表达的影响.方法 将入神经母细胞瘤细胞和稳定表达淀粉样前体蛋白的人神经母细胞瘤细胞培养6～8 d,先后用不同浓度的亚硒酸钠和4-羟基壬烯酸(HNE)各处理24 h后收获细胞.用直接荧光法检测α-、β-、γ-分泌酶活性;用酶联免疫吸附试验检测细胞中分泌型β-淀粉样蛋白(sAPP)、Aβ-40和Aβ-42的表达;用Western Blotting和Real-time PCR技术分别测量淀粉蛋白前β位分解酶1 (BACE1)蛋白和mRNA的表达.结果 亚硒酸钠处理后细胞中β-、γ-分泌酶活性降低,差异具有统计学意义(F=31、16,P＜0.05);sAPPβ、Aβ-40、Aβ-42表达减少,差异具有统计学意义(F=56,t=13、12,P＜0.01);BACE1蛋白和mRNA的表达减少,差异具有统计学意义(F=9 161、213,P＜0.01).结论 亚硒酸钠可能通过限制HNE介导的BACE1的表达降低Aβ的产生.
关键词： 亚硒酸钠 阿尔茨海默病 淀粉样前体蛋白分泌酶类 淀粉样β蛋白 -
慢性乙醇中毒脑β-淀粉样前体蛋白与外伤性蛛网膜下腔出血死亡的关系
目的 观察大鼠慢性乙醇中毒下脑组织轻微伤后β-淀粉样前体蛋白(β-amyloid precursor protein,β-APP)的表达,探讨乙醇中毒与外伤性蛛网膜下腔出血(traumatic subarachnoid haemorrhage,TSAH)死亡的相关性. 方法 雄性SD大鼠60只,随机分为灌水组、灌水打击组、灌酒组、灌酒打击组.灌酒组以食用酒连续灌胃4周,打击组予脑震荡打击,各组大鼠脑组织行HE、免疫组织化学染色,组织病理图像系统量化分析检测结果.结果 灌水组脑无异常；灌水打击组全脑神经元轻度水样变性;灌酒组脑表面可见血管纹理,神经纤维排列稍疏松、间隙增大;灌酒打击组脑表面弥漫性淤血,脑干周围多见厚层斑片状TSAH,轴索不规则断裂.灌酒组额叶、海马、小脑、脑干β-APP IOD值高于灌水打击组及灌酒打击组. 结论 慢性乙醇中毒脑组织的耐受性明显下降,轻微损伤情况下即可引起致死性TSAH和神经病理学变化.
