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以PLK1 PBD为靶点的小分子抑制剂筛选及其抗癌活性研究
目的利用荧光偏振模型进行 PLK1 PBD 抑制剂的高通量筛选，并对阳性化合6143D7的抗癌效果进行体外评价。
方法采用噻唑蓝比色法检测初筛阳性化合物对不同细胞系增殖的影响；流式细胞术检测化合物对细胞周期以及凋亡率的影响；分子对接检测化合物与 PLK1 PBD 结构域的亲和性。
结果利用荧光偏振模型得到的阳性化合物6143D7经噻唑蓝比色法检测显示能抑制癌细胞的增殖；流式细胞仪检测显示该化合物加药组 G2/M 期细胞比例高于对照组并能促进细胞凋亡；分子对接结果表明化合物与 PLK1 PBD 结构域的亲和性良好。
结论该化合物通过抑制 PLK1 PBD 结构域的活性发挥抗癌作用，有望成为靶向 PLK1的抗肿瘤先导化合物。关键词： 蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶 药物筛选试验 抗肿瘤 荧光偏振 polo样激酶1抑制剂 -
散发性预激综合征与PRKAG2基因多态性的关系
目的 探讨散发性预激综合征与PRKAG2基因多态性的关系.方法 散发性预激综合征患者和健康受试者各65例,提取外周血白细胞基因组DNA,聚合酶链反应扩增PRKAG2基因片段,限制性片段长度多态性技术及DNA片段测序法检测基因多态性.结果 测序结果与NCBI Genebank BLAST软件进行对比,未发现突变点.结论 散发性预激综合征与PRKAG2基因多态性无关.
关键词： 预激综合征/遗传学 多酶复合物 蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶 多态现象 遗传 -
有丝分裂关卡基因致染色体数目异常自然流产胚胎发生的机制
目的 探讨有丝分裂关卡基因(hBUB1)在染色体数目异常自然流产胚胎发生中的可能机制.方法 采用实时定量逆转录(RT)-PCR和免疫印迹法(WB)检测染色体数目异常组和正常对照组的自然流产胚胎组织中目的 基因在mRNA和蛋白水平的表达;构建针对hBUB1基因的短发卡状(shRNA)表达载体,用细胞免疫化学、WB和实时定量RT-PCR方法评价其对胚胎细胞内源性hBUB1表达的干扰效果;用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTF)试验测定细胞增殖抑制率;用流式细胞术解析细胞周期分布.结果 hBUB1蛋白在染色体数目异常组中的表达显著低于正常对照组(阳性表达率分别为8%和93.5%,P＜0.05).shRNA的重组质粒表达载体能明显抑制胚胎细胞中hBUB1基因的表达(干扰前后mRNA水平分别为0.196±0.067和0.042±0.006,P＜0.05).胚胎细胞转染有效干扰质粒48 h后,染色体数目异常组细胞增殖抑制率达62%,显著高于正常对照组(4%,P＜0.05).有效干扰质粒引起G2/M期细胞从对照组的40.2%和41.3%降低至21.3%.结论 hBUB1基因表达下调可导致细胞增殖的抑制和周期的改变,在染色体数目异常自然流产胚胎发生中可能起很重要的作用,这将为寻找可靠的临床检测指标奠定基础.
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低氧致大鼠肺动脉平滑肌细胞中PTEN/Akt1表达的变化与细胞增殖的关系
目的 通过观察低氧致大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMC)与细胞张力蛋白同源在10号染色体有缺失的磷酸酶(PTEN)和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(Akt1)mRNA及其蛋白表达水平的变化与低氧PASMC增殖的关系,探讨PTEN/Akt1信号途径在低氧肺血管重建中的可能调控作用.方法 用组织块法培养PASMC.采用半定量逆转录-PCR技术检测常氧组、低氧2、8、12、24 h组PTEN、Akt1基因mRNA的表达水平,采用Western blot技术检测相应的蛋白表达水平.采用噻唑蓝比色法和氚-胸腺嘧啶脱氧核苷(3H-TdR)掺入法检测PASMC的增殖改变.数据用x±s表示,采用Excel 2003软件进行t检验,P<0.05为差异有统计学意义.结果低氧刺激PASMC不断增殖,3H-TdR法检测的吸光度值低氧12 h组(0.70±0.10)比常氧组(0.37±0.06)明显增高(t=14.29,P<0.01);噻唑蓝法检测的吸光度值低氧24 h组(11 208±679)比常氧组(8374±545)明显增高(t=19.56,P<0.01).各组均检测出PTEN、Akt1基因mRNA及蛋白表达的变化.常氧组Akt1的mRNA、总蛋白、磷酸化蛋白的吸光度值分别为0.76±0.09、25±6和48±8,随着低氧培养时间延长,吸光度值逐渐升高,低氧8 h组达到高峰,分别为1.05±0.09、41±7和79±14,与常氧组比较,差异均有统计学意义(t值为8.31～168.00,P<0.05和P<0.01),随后开始下降,低氧24 h组恢复至常氧组水平.常氧组PTEN的mRNA、磷酸化蛋白的吸光度值分别为0.25±0.06和98±8,并随着低氧培养时间延长而逐渐升高,低氧24 h组达到高峰,分别为0.38±0.05和232±12,与常氧组比较,差异均有统计学意义(t值分别为22.04和50.46,均P<0.01).结论 PTEN/Akt1的转录和激活与低氧肺血管重建的PASMC增殖密切相关.
关键词： 肌细胞 平滑肌 蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶 高血压 肺性 -
糖皮质激素诱导的蛋白激酶1对早期动脉粥样硬化形成中的研究进展
动脉粥样硬化是动脉硬化的血管疾病中常见、重要的一种类型,可累及主动脉、冠状动脉、颅脑动脉及全身其他大中动脉血管,并能导致心脑血管事件发生,危及生命.动脉粥样硬化已被公认是血管壁的一种慢性炎症疾病,在炎性反应过程中,单核细胞和(或)巨噬细胞参与其中,其迁移及发挥作用依赖于基质金属蛋白酶(MMP)中的MMP-9的激活,而NF-κB转录的过程能够激活MMP-9的表达,NF-κB的转录受其的抑制蛋白(IkB激酶)的调控,IkB激酶则受血清和糖皮质激素诱导的蛋白激酶1 (SGK1)的调节.SGK1可通过磷酸酰肌醇激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路激活IκB激酶从而参与血管壁的慢性炎性反应的过程.因此,SGK1不但能够调控单核细胞和(或)巨噬细胞的迁移,而且有可能调节单核细胞和(或)巨噬细胞的募集和入侵,有可能在血管炎和早期动脉粥样硬化形成中起着重要作用.
关键词： 糖皮质激素类 蛋白激酶类 动脉粥样硬化 蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶 巨噬细胞 -
磷酯酰肌醇-3-激酶、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶在2型糖尿病大鼠骨组织中的表达及意义
目的 探讨磷酯酰肌醇-3-激酶(PI3K)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Akt)在糖尿病大鼠骨组织中的表达及意义.方法 将50只体重180 ～ 200 g的6月龄雌性Wistar大鼠按随机数字表法分为对照组(n=24)和2型糖尿病组(n=26).2型糖尿病组大鼠予高糖高脂饮食喂养8周后,腹腔注射链脲佐菌素30 mg/kg,对照组大鼠正常饮食.糖尿病成模后12周两组大鼠分别行腰椎骨密度测定；应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测骨组织PI3K、Akt1和Akt2 mRNA的相对表达.组间比较采用t检验.结果 对照组大鼠骨密度高于糖尿病组,差异有统计学意义[(0.079±0.034)比(0.060±0.017)g/cm2,t=2.499,P ＜0.05]；同时,对照组大鼠骨组织PI3K、Akt1 、Akt2 mRNA均高于糖尿病组(分别为:0.65±0.05比0.51 ±0.04、0.756 ±0.031比0.694±0.017、0.77±0.04比0.66±0.04),差异均有统计学意义(t=4.969、3.924、4.515,均P＜0.01).结论 2型糖尿病大鼠骨组织PI3K、Akt1及Akt2表达低于正常,这可能是2型糖尿病骨质疏松发生的分子生物学机制之一.
关键词： 糖尿病 2型 骨密度 磷酯酰肌醇类 蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶 -
Pim-1在肝细胞癌患者体内的表达规律及与癌基因c-Myb的关系
目的 明确Pim-1在肝细胞癌患者体内的表达规律及与癌基因c-Myb的关系.方法 选择2009年1月-2013年10月在第四军医大学第一附属医院肝胆外科接受外科手术治疗的136例肝细胞癌患者,收集其临床资料及切除的癌组织及癌旁组织,并完成随访工作.采取门诊复查或电话的方式进行术后随访.随访截止日期为2017年6月28日.至研究结束,失访14例,终有122例肝细胞癌患者纳入研究.同时,收集同期因肝血管瘤患者行手术切除的正常肝脏组织85例为正常对照组.采用免疫组织化学染色(IHC)方法检测以上组织中Pim-1和c-Myb蛋白的表达情况.以Western blotting实验检测人肝癌细胞系SMMC-7721、HepG2、Hep3B、Huh7、MHCC-97L、MHCC-97H细胞及正常人肝细胞系L-02、HL-7702细胞中Pim-1蛋白的表达情况.两样本均数的比较采用Student's t检验.计数资料采用x2检验或Spearman相关性分析.结果 Pim-1蛋白在肝细胞癌组织中的总阳性表达率为88.5％(108/122),显著高于癌旁组织73.0％(89/122)和正常肝组织69.4％ (59/85) (x2=9.513,P=0.003;x2=11.739,P=0.001).c-Myb的总阳性表达的有96例,其中Pim-1和c-Myb均为阳性表达的有88例;Spearman相关性分析表明,Pim-1蛋白与c-Myb蛋白在肝细胞癌组织中的表达呈正相关(r =0.107,P=0.037).与L-02和HL-7702细胞比较,人肝癌细胞系SMMC-7721、HepG2、Hep3B、Huh7、MHCC-97L、MHCC-97H细胞内Pim-1含量均显著升高(P＜0.01).结论 Pim-1在肝细胞癌组织和多种肝癌细胞中的表达水平显著升高,且与原癌基因c-Myb的表达呈正相关,与肝细胞癌的发生、发展有重要关系.
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Dyrk1b蛋白在不同程度子宫颈病变组织及子宫颈癌细胞中的表达及意义
目的：探讨双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1b（Dyrk1b）蛋白在不同程度子宫颈病变组织及子宫颈癌细胞中的表达及意义。方法（1）组织标本检测：选取2011年1月至2013年12月间就诊于大连医科大学附属第一医院，经病理检查证实的子宫颈鳞癌75例（其中Ⅰ期60例，Ⅱ期15例）、低级别鳞状上皮内病变（LSIL）12例、高级别鳞状上皮内病变（HSIL）40例患者的石蜡组织标本；另取同期经病理检查确诊的28例慢性子宫颈炎患者的子宫颈组织为对照。采用免疫组化SP法检测不同程度子宫颈病变组织中Dyrk1b蛋白的表达情况，并分析子宫颈癌组织中Dyrk1b蛋白的表达与其不同临床病理指标的关系。（2）细胞实验：采用子宫颈癌细胞系HeLa和SiHa细胞，实验分为两组，实验组细胞中加入Dyrk1b抑制剂——AZ191，对照组细胞中不加AZ191。采用蛋白印迹法检测不同浓度（5、10μmol/L）的AZ191作用后两组细胞中Dyrk1b蛋白的表达；四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测不同浓度（2.5、5、10、25、50、100μmol/L）的AZ191作用后两组细胞的增殖情况；流式细胞仪检测不同浓度（5、10μmol/L）的AZ191作用后两组细胞的凋亡情况。结果（1）免疫组化SP法检测显示，慢性子宫颈炎、LSIL、HSIL和子宫颈鳞癌组织中Dyrk1b蛋白阳性表达率分别为11%（3/28）、1/12、42%（17/40）、71%（53/75），子宫颈鳞癌明显高于慢性子宫颈炎、LSIL、HSIL（P<0.01）；HSIL明显高于慢性子宫颈炎、LSIL（P<0.05）；而LSIL与慢性子宫颈炎比较，差异无统计学意义（P>0.05）。子宫颈鳞癌组织中Dyrk1b蛋白的表达与子宫颈肌层浸润深度显著相关（P<0.01），而与年龄、临床分期、淋巴结有无转移以及血清鳞状上皮细胞癌抗原（SCC-Ag）水平均无显著相关性（P>0.05）。（2）蛋白印迹法检测显示，不同浓度（5、10μmol/L）的AZ191作用后，实验组HeLa和SiHa细胞中Dyrk1b蛋白的表达强度均随着AZ191浓度的增加而减弱，且均明显弱于对照组。MTT比色法检测显示，不同浓度（2.5、5、10、25、50、100μmol/L）的AZ191作用后，实验组HeLa和SiHa细胞增殖的抑制率随着AZ191浓度的增加均逐渐增高，呈明显的浓度依赖性（P<0.01）；且均明显高于对照组（P<0.05）。但实验组中同一浓度A2191作用后HeLa细胞与SiHa细胞增殖的抑制率分别比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。流式细胞仪检测显示，5μmol/L的AZ191作用后，实验组HeLa和SiHa细胞的凋亡率[分别为（12.8±0.7）%、（3.8±1.8）%]分别与对照组[分别为（9.1±0.9）%、（2.2±1.1）%]比较，差异均无统计学意义（P>0.05）；而10μmol/L的AZ191作用后，实验组HeLa和SiHa细胞的凋亡率[分别为（15.5±1.1）%、（8.4±3.3）%]均明显高于对照组（P<0.05）。但实验组中同一浓度AZ191作用后HeLa细胞与SiHa细胞的凋亡率分别比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。结论随着子宫颈病变程度的进展，Dyrk1b蛋白的表达逐渐增高，子宫颈癌组织和细胞中Dyrk1b蛋白均呈高表达；Dyrk1b抑制剂AZ191下调Dyrk1b蛋白表达后，可抑制子宫颈癌细胞的增殖，诱导细胞发生凋亡。
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子痫前期患者胎盘和脐动脉组织Rho相关蛋白激酶Ⅱ的表达及意义
目的 探讨子痫前期患者胎盘和脐动脉组织中Rho相关蛋白激酶Ⅱ(RockⅡ)的表达变化及其意义.方法 采用RT-PCR、蛋白印迹法分别检测35例轻度子痫前期患者(轻度子痫前期组)、38例重度子痫前期患者(重度子痫前期组)及45例正常晚期妊娠妇女(对照组)胎盘及脐动脉组织中RockⅡmRNA及其蛋白表达水平;采用免疫组化方法 对RockⅡ在胎盘组织中的表达进行定位,B超检测脐动脉收缩期大血流速度(S)与舒张末期血流速度(D)的比值.结果 (1)RockⅡ主要表达于胎盘合体滋养细胞的细胞质.(2)轻度子痫前期组、重度子痫前期组及对照组胎盘组织RockⅡmRNA表达水平分别为0.82±0.14、0.93±0.13及0.70 4-0.12,分别比较,差异也均有统计学意义(P＜0.01);轻度子痫前期组、重度子痫前期组及对照组胎盘组织RockⅡ蛋白表达水平分别为0.79±O.15、0.92±0.12及0.68±0.11,分别比较,差异也均有统计学意义(P＜0.01).(3)轻度子痫前期组、重度子痫前期组及对照组脐动脉组织RockⅡmRNA表达水平分别为0.69±0.13、0.55±0.12及0.76±0.10,分别比较,差异也均有统计学意义(P＜0.01);轻度子痫前期组、重度子痫前期组及对照组脐动脉组织RockⅡ蛋白表达水平分别为0.68±0.10、0.51±0.12及0.75±0.13,分别比较,差异也均有统计学意义(P＜0.01).(4)脐动脉组织RockⅡmRNA及蛋白表达水平与脐动脉S/D值均无相关性(P＞0.05).结论 RockⅡ在子痫前期患者胎盘组织中的表达水平升高,在脐动脉组织中的表达水平降低,可能参与了子痫前期的病理、生理过程.
关键词： 先兆子痫 蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶 胞间信号肽类和蛋白质类 胎盘 脐动脉 -
整合素连接激酶反义寡核苷酸对卵巢上皮性癌细胞生长的抑制作用
目的 探讨整合素连接激酶(ILK)反义寡核苷酸(ASODN)对卵巢上皮性癌(卵巢癌)细胞生长的抑制作用.方法 将ILK-ASODN转染入卵巢癌细胞株H08910细胞,阻断其表达ILK.实验分为6组,分别为空白对照组(A组)、脂质体对照组(B组)、ILK-正义寡核苷酸(SODN)100 nmol/L组(C组)和ILK-ASODN 60 nmol/L组(D组)、ILK-ASODN 80 nmol/L组(E组)、ILK-ASODN 100 nmol/L组(F组).采用RT-PCR技术和蛋白印迹法检测各组H08910细胞ILK mRNA和蛋白表达量的变化;水溶性四氮唑1(WST-1)法及流式细胞术评价H08910细胞转染ILK-ASODN后对该细胞体外增殖的抑制作用及对该细胞周期和凋亡的影响.结果 ILK-ASODN转染后H08910细胞ILK mRNA表达量明显下降,D、E、F 3个实验组分别为0.307±0.011、0.198±0.008、0,与A、B两对照组(分别为0.343±0.006、0.342±0.009)比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).ILK-ASODN转染后H08910细胞ILK蛋白表达量也明显下降,D、E、F 3个实验组分别为26.3±0.8、20.6±0.4、0;细胞生长受到明显抑制,细胞凋亡率明显增高,3个实验组分别为7.31%、8.84%、11.27%;G0/G1期细胞增多,3个实验组分别为49.25%、56.28%、67.61%.以上指标分别与A、B组比较,差异均有统计学意义(P＜0.01).结论 ILK-ASODN转染卵巢癌H08910细胞后可以明显抑制其生长.
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脐血内皮祖细胞中整合素连接激酶在子痫前期发病机制中的作用
目的 探讨整合素连接激酶(integrin linked kinase,ILK)在子痫前期患者脐血内皮祖细胞中的表达及其在新生血管形成中的作用. 方法 采用逆转录聚合酶链反应和Western印迹实验分别检测35例正常孕妇(正常妊娠组)和30例子痫前期孕妇(子痫前期组,其中轻度18例,重度12例)的脐血内皮祖细胞中ILK mRNA和蛋白的表达,采用小管形成实验检测内皮祖细胞血管形成能力；分析ILK mRNA和蛋白表达的差异及其与血管管状结构形成的相关性.统计学分析采用方差分析和相关分析. 结果 (1)正常妊娠组内皮祖细胞中ILK mRNA相对吸光度(A)值较子痫前期组显著升高(0.64±0.05与0.45±0.06),轻度子痫前期组较重度者显著升高(0.47±0.07与0.39±0.08)(q=18.76和5.13,P＜0.05)；正常妊娠组内皮祖细胞中ILK蛋白A值较子痫前期组明显升高(32±2与26±1),轻度子痫前期组较重度者显著升高(25±2与20±2)(q=18.47和4.72,P均＜0.05).(2)正常妊娠组小管结构形成的数量较子痫前期组显著增多(330±8与135±7),重度子痫前期组的小管形成的数量明显少于轻度者(116±8与148±6)(q=152.70和5.42,P均＜0.05).(3)内皮祖细胞中ILK mRNA及其蛋白表达与其小管形成均呈正相关关系,正常妊娠组相关系数(r)分别为0.69和0.73,子痫前期组分别为0.67和0.72;轻度子痫前期组分别为0.65和0.68,重度组分别为0.63和0.74(P均＜0.05). 结论 子痫前期患者内皮祖细胞中ILK mRNA及其蛋白表达下降可能与子痫前期的发生密切相关.
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RhoA/Rho激酶在高肺血流肺血管结构重构中的表达及其活性研究
目的 探讨RhA/Rho激酶在高肺血流所致肺血管结构重构过程中所起的作用.方法 108只4周龄Wistar大鼠随机分到4个分流组、4个对照组,分流组大鼠接受左侧颈总动脉-颈外静脉分流术,对照组大鼠作假手术.在术后1、2、4、8周,分别测量右心室收缩压,作血气分析计算Qp/Qs.肺组织切片HE染色光镜下观察肺血管形态学改变,测量并计算中等血管中膜厚度所占管径百分比(MT%).免疫组化增殖细胞核抗原(PCNA)染色分析平滑肌细胞增生情况.用TUNEL细胞凋亡标记分析平滑肌细胞凋亡状况.pull down assay分析RhoA活性,Western blot检测RhoA、Rho激酶(ROCK2)的蛋白表达以及MYPT1磷酸化程度量化分析Rho激酶活性.结果 颈总动脉-颈外静脉分流导致肺循环血流量增加,Qp/Qs平均值为2.26±0.35.分流组RVSP在术后1周和8周较对照组高(t=8.799,t=5.332,P＜0.01).与对照组相比,分流组以平滑肌细胞过度增生和肥大为特征的中等肺动脉中膜增厚,MT%升高在第4周开始出现,到第8周更为明显(t=9.192,t=11.185,P＜0.01).分流组PCNA阳性平滑肌细胞在第1周显著升高,第2周达高值,与对照组相比,差异有统计学意义(t=7.213,P＜0.01),到第4周下降到显著低于对照组(t=4.183,P＜0.01),并持续降低,到第8周几乎观察不到增生的平滑肌细胞(t=6.152,P＜0.01).TUNEL阳性平滑肌细胞在第2周较对照组低(t=2.418,P＜0.05),并持续降低,到第8周几乎观察不到凋亡的平滑肌细胞(t=4.582,P＜0.01).RhoA和ROCK2表达在第1周即高于对照组(t=6.056,t=8.411,P＜0.01),第2周达高峰(t=9.342,t=10.437,P＜0.01).到第4开始下降,但是到第8周仍然显著高于对照组(t=4.743,t=4.455,P＜0.01).RhoA和Rho激酶活性在第1周也显著高于对照组(t=10.246,t=19.110,P＜0.01),到第4周达高峰(t=24.984,t=16.124,P＜0.01),然后开始降低,但是二者到第8周仍然显著高于对照组水平(t=4.934,t=10.426,P＜0.01).结论 在高肺血流所致的大鼠肺血管收缩和结构重构与RhoA/Rho激酶的表达和活性增强有关.
关键词： 高血压 肺性 蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶 胞间信号肽类和蛋白质类 肺循环 -
色素失禁症NEMOΔ4～10基因片段缺失的初步研究
目的了解我国色素失禁症病例的NEMO基因共有序列NEMOΔ4～10 缺失情况.方法儿童色素失禁症病例7例及其部分家庭成员共15人被纳入实验组,同期50例无血缘关系,无遗传性疾病儿童随机抽取作为正常对照.依据色素失禁症基因结构特点,选取NEMO基因特异引物In2/JF3R和假基因ΔNEMO特异引物Rev-2/JF3R,采用长链聚合酶链反应(PCR)进行检测.结果 7例患儿5例(5/7)(例1、2、3、4和6)有NEMO基因共有序列NEMOΔ4～10 缺失,其中例1和例6母女患病,母亲1a和6a检测结果同样显示有NEMO基因共有序列NEMOΔ4～10 缺失;7例患儿,只有例2和例4假基因ΔNEMO中出现共有序列 NEMOΔ4～10缺失,相关家族成员假基因ΔNEMO无共有序列NEMOΔ4～10缺失.正常对照组50例NEMO和假基因ΔNEMO均未发现有共有序列NEMOΔ4～10缺失.结论色素失禁症基因突变方式大部分为NEMO基因共有序列NEMOΔ4～10 缺失.
关键词： 色素失禁症 基因缺失 聚合酶链反应 蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶 -
骨癌痛大鼠DRG神经元GRK2和β-arrestin2表达以及NGF调节作用的研究
目的:观察大鼠骨癌痛时脊髓背根神经节(DRG)G蛋白偶联受体激酶2(GRK2)和β-arrestin2的变化,探讨鞘内注射抗神经生长因子抗体(anti-NGF)对其表达及疼痛行为学的影响.方法:60只雌性SD大鼠随机分为假手术组、骨癌痛组及骨癌痛+anti-NGF组,13 d后鞘内置管,16 d开始鞘内注入生理盐水或anti-NGF不同时点观察疼痛行为学变化;21 d取同侧L4、L5 DRG,检测β-arrestin2、GRK2蛋白及mRNA表达变化.结果:与假手术组比较,骨癌痛组大鼠体质量减轻[(219±4.8)vs(243±8.1)],自发缩足次数增多[(24.1±3.6)vs(2.9±0.4)],热辐射潜伏期(PWL)缩短[(3.8±0.5)vs(10.9±1.3)],机械痛阈(PWT)降低[(3.2±1.1)vs(12.3±1.3)];与骨癌痛组比较,骨癌痛+anti-NGF组大鼠缩足次数减少(6.7±1.2),PWL延长(9.7±1.2),PWT增高(9.7±1.5).骨癌痛组大鼠β-arrestin2、GRK2表达均高于假手术组,而骨癌痛+anti-NGF组则明显低于骨癌痛组.骨癌痛组大鼠DRG神经元β-arrestin2与GRK2 mRNA的表达均高于假手术组,而骨癌痛+anti-NGF组则均低于骨癌痛组.结论:大鼠骨癌痛时DRG神经元GRK2和β-arrestin2的表达增加,anti-NGF可明显缓解骨癌痛,并对GRK2和β-arrestin2具有调制作用.
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选择性COX-2抑制剂对非小细胞肺癌细胞株毒性及分子机制的研究
目的:探讨选择性环氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)抑制剂Celecoxib对非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)细胞株增殖与凋亡的作用以及相关分子机制.方法:对3种NSCLC细胞株A549(腺癌)、GLC82(腺癌)和SW1573(肺泡细胞癌)使用MTT法测定细胞生长抑制率;Hoechest33258荧光染色观察细胞凋亡;流式细胞仪分析细胞凋亡及细胞周期分布;Western blot法检测COX-2、磷酸化AKT(p-AKT)、总丝苏氨酸激酶(serine/threonine kinase,AKT)、磷酸化ERK(p-ERK)及总细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK) 蛋白的表达.结果:Celecoxib抑制A549、GLC82和SW1573细胞增殖的IC50值分别为14.7、10.6和18.6 μmol/L;Celecoxib对3种NSCLC细胞株都有较明显的凋亡诱导作用,Celecoxib作用12 h凋亡率增加,24～48 h更明显,Celecoxib 10～40 μmol/L作用可见凋亡率明显增加;Celecoxib作用于GLC82细胞后检测到胞内p-AKT及p-ERK蛋白表达下调.结论:COX-2抑制剂Celecoxib在体外能抑制细胞信号传导AKT及ERK通路的活化,诱导NSCLC细胞发生凋亡,抑制细胞增殖.
关键词： 癌 非小细胞肺 细胞凋亡 蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶 细胞外信号调节MAP激酶类 -
ILK基因RNAi慢病毒表达载体的构建与鉴定
目的:进一步研究整合素连接激酶(ILK)的功能,构建ILK基因RNAi慢病毒载体,并对其在肺腺癌A549细胞株中干扰效率进行鉴定.方法:针对ILK基因RNAi有效靶序列,合成4对oligo DNA,退火形成双链DNA,与经AgeI和EcoRI酶切的质粒pGCSIL-GFP载体连接产生shILK-LV慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定,用shILKi-LV载体、pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体共转染包装细胞293 T细胞,包装产生慢病毒,以293 T细胞绿色荧光蛋白(GFP)的表达水平测定病毒滴度.获得重组慢病毒后感染人肺癌A549细胞,荧光显微镜观察GFP及Real-time PCR检测ILK在A549细胞中的表达.结果:PCR扩增出插入片段,测序证实成功构建了ILK-shRNA慢病毒载体shILKi-LV.包装并浓缩慢病毒,滴度分别为6×108、6×108、5×108和4×108 pfu/mL;将病毒感染A549细胞,荧光显微镜下观察80％细胞表达绿色荧光,Real-time PCR检测ILK mRNA表达明显下降,其中染shILKFKD-1的A549细胞中ILK2-△△Ct值为0.058,shILKi-KD-2、3和4的ILK2-△△Ct值分别为0.162、0.072和0.119,尤以ILKsiRNA-1抑制明显.结论:成功构建shILKi-LV病毒载体并建立了A549-shILKi细胞模型,为ILK在肺癌信号转导通路中的研究提供了工作基础.
关键词： 蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶 慢病毒感染 肺肿瘤 基因表达 -
有丝分裂激酶Aurora-A介导乳腺癌发生与耐药的研究进展
有丝分裂激酶 Aurora-A 是哺乳动物细胞Aurora激酶家族中的成员之一。 Aurora-A通过参与中心体的分离、成熟以及两极纺锤体的建立，从而确保有丝分裂中染色体正确分离和细胞质分裂顺利完成，在细胞周期中起着重要的作用。其过表达与乳腺癌密切相关。笔者就 Aurora-A 与乳腺癌发生及耐药的关系进行综述。
关键词： 蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶 乳腺肿瘤 抗药性 肿瘤 -
染色体12p13两基因间多态与脑梗死的关系
目的 探讨染色体12p13两基因间rs11833579G＞A和rs12425791G＞A多态位点与福建汉族人腩梗死及亚型的关系。方法 采用病例-对照研究，联合聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析及直接测序技术检测基凶型，对216例脑梗死患者及279名健康对照者上述两位点进行基因型、基因频率比较及关联分析。结果 脑梗死组rs12425791位点GA基因型频率低于对照组(分别为34.3％和43.4％，x2 =4.298，P＜0.05)，大动脉粥样硬化型脑梗死亚组该基冈型频率虽略低于对照组，但差异无统计学意义。Logistic多因素回归分析提示rs12425791位点GA基因型个体发生大动脉粥样硬化型脑梗死的风险降低(OR =0.613,95％ CI0.396～0.949,P=0.028)，男性亚组中GA基因型罹患脑梗死的风险较低(OR =0.597,95％ CI0.364 -0.978，P=0.041)。rs11833579位点对患病风险无明显影响。结论 rs12425791位点可能是福建汉族人动脉粥样硬化型脑梗死的遗传风险标记。
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赖氨酸蛋白缺乏激酶1基因多态性与维吾尔族人缺血性卒中的关联研究
目的 探索赖氨酸蛋白缺乏激酶1( with no lysine[K]1,WNK1)基因单核苷酸多态性(SNP)与中国维吾尔族缺血性卒中的关系.方法 收集295例维吾尔族缺血性卒中患者和318例其他疾病对照者,进行病例对照研究.用标签SNP( tagging-SNP,tSNP)策略选择WNK1基因10个SNP位点( rs3858703、rs11611246、rs7305065、rs1990021、rs34408667、rs12309274、rs1012729、rs956868、rs12828016、rs953361).SNPs基因分型检测采用SNaPshot平台.用t检验、卡方检验和Logistic回归分析对数据进行统计分析,用Haploview软件进行连锁不平衡分析和单倍型分析.结果 rs11611246位点T等位基因在对照组中的分布(30.0％)高于病例组(25.6％),但是差异无统计学意义.用性别进一步分层分析,发现rs11611246 T等位基因是维吾尔族女性卒中发病的保护因子.显性遗传模型显示T等位基因携带者发生缺血性卒中的风险是对照组的0.448倍(95％ CI 0.269 ～0.746,P＝0.002).调整年龄后差异仍有统计学意义,进一步调整混杂因素年龄、体质量指数、吸烟、饮酒、高血压、糖尿病、高脂血症后,差异仍有统计学意义.除此之外,WNK1基因其余9个SNPs位点未发现同维吾尔族人脑梗死相关.结论 我们首次发现WNK1基因第4内含子rs11611246多态影响缺血性卒中的发生,rs11611246位点T等位基因可能是维吾尔族女性发生缺血性卒中的保护因素.
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大鼠癫痫持续状态后肌醇酶1α介导的内质网应激相关凋亡分子在海马中的表达
目的 探讨肌醇酶1α(inositol requiring enzyme 1α,IRE 1α)介导的内质网应激相关凋亡分子在大鼠癫痫持续状态(SE)后海马神经元损伤中的作用.方法 Wistar大鼠按随机数字表随机分为对照组、SE组,SE组根据不同时间点又分为3、6、12、24、48 h组.免疫荧光法观察葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulating protein 78 kd,GRP78)及磷酸化-IRE1α(p-IRE1α)在各组大鼠海马CA3区中的表达；蛋白质印迹检测磷酸化c-Jun N端激酶(p-JNK)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12(caspase 12)的表达变化；荧光TUNEL观察各组大鼠海马CA3区神经元凋亡变化.结果 免疫荧光结果显示,对照组仅见少量GRP78、p-IRE1α阳性神经元(分别为6.90％±0.96％,4.60％±1.12％),SE各亚组GRP78、p-IRE1α阳性神经元均增多,SE后12h达高峰(GRP78:87.45％±3.63％,F=356.82,P＜0.05；p-IRE1α:86.90％±3.82％,F=300.80,P＜0.05)；蛋白质印迹结果显示,与对照组相比,p-JNK、caspasel2在SE各亚组表达均增多,SE后12 h达高峰；同时TUNEL染色在SE各亚组均能检测到海马神经元凋亡,以SE后12h凋共严重,与p-IRE1α、p-JNK、caspase12表达变化一致.结论 大鼠SE后诱发了内质网应激,表现为内质网应激标志分子GRP78表达增加；IRE1α可能通过磷酸化JNK和活化caspase12参与了SE后神经元凋亡损伤.
