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浙江省台州市两株狂犬病病毒流行株的基因序列分析
目的 分析浙江省台州市2株狂犬病病毒核蛋白及糖蛋白的基因序列,了解狂犬病病毒野毒株与人用及兽用狂犬病疫苗株间的差异.方法 以免疫荧光法检测2008年采自台州市的144只犬脑标本,以RT-(nested)PCR法扩增病毒核蛋白及糖蛋白全基因,克隆测序后以生物信息学软件进行遗传特征分析.结果 检测到2株狂犬病病毒阳性样品,序列分析表明两样品所携病毒均为基因1型狂犬病病毒,所携病毒的N基因核苷酸及氨基酸同源性均为100%,G基因核苷酸和氨基酸同源性分别为99.8%和99.4%.所携病毒与CTN疫苗株核苷酸同源性较高,N基因与G基因分别为88.8%和85.9%～86.1%,两样品所携病毒与Hep-Flury疫苗株的核蛋白氨基酸同源性高,为97.6%,CTN次之,为97.1%,与CTN糖蛋白氨基酸同源性较高,为92.3%～92.5%.与诸基因1型狂犬病病毒参考株相比,两样品所携病毒与浙江温州Wz0(H)、衢州株ZJ-QZ及印度尼丙亚株病毒同源性高.系统发育分析表明XY20及JJ22与浙江温州Wz0(H)、衢州株ZJ-QZ以及印度尼西亚株、疫苗株CTN,以及泰国与马来西亚株进化关系近,而与疫苗株aG、PV、ERA,及标准攻击毒CVS株等进化关系较远.结论 两份阳性犬脑所携狂犬病病毒是基因1型狂犬病病毒,但无论是N基因还是G基因的核苷酸序列,以及推导出来的氨基酸序列与已知的1型狂犬病病毒株及疫卣株存在差异.
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湖南省武岗市洞口县狂犬病流行病学研究
目的分析2003-2004年间在湖南省武岗市与洞口县发生的狂犬病并探讨局部地区流行的因素.方法对狂犬病进行个案调查,用直接免疫荧光法检测犬脑组织中的狂犬病毒抗原,用RT-PCR法扩增N基因片段,测定核苷酸序列并构建系统发生树进行遗传特征分析.结果自1991-2002年武岗市与洞口县仅各报告1例人狂犬病,但2003-2004年间,分别报告30例人狂犬病.62例狂犬病患者中61例被犬所伤,1例被猫所伤.在有完整记录的50例患者中,平均潜伏期为44.18天.其中7例(14%)狂犬病患者的潜伏期≤15天,16例(32%)潜伏期≤20天.在疫点周围采集的99只犬脑组织中,13只犬脑组织狂犬病毒抗原阳性,阳性率为13.13%.将Wg13与Dk13株病毒的部分N基因核苷酸序列与已报道中国病毒株比较,发现2株病毒与广西及安徽的毒株有高的同源性,构建的系统发生树也分在同一分支.用全N基因核苷酸序列分析发现,Wg13与Dk13毒株全为Ⅰ型狂犬病毒,2株病毒之间的同源性为99.4%以上.比较分析2株病毒N基因编码的氨基酸序列,发现包括第Ⅳ抗原位点区在内的多个氨基酸位点发生了氨基酸的替代.结论引起武岗市与洞口县的狂犬病流行的病毒不是新型狂犬病毒,犬饲养量大与病毒携带率高是狂犬病暴发的直接原因.
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河南省两株狂犬病毒核蛋白和糖蛋白基因的序列分析
目的 分析河南省2株狂犬病毒核蛋白及糖蛋白的基因序列,了解狂犬病毒街毒株与人用及兽用狂犬病疫苗株间的差异.方法 以免疫荧光法检测2004年采自河南省的100只犬脑标本,取阳性犬脑组织悬液接种鼠脑分离病毒.以RT-PCR法扩增病毒核蛋白及糖蛋白全基因,克隆测序后进行遗传学分析.结果 分离到2株狂犬病毒,分别命名为Henan Hb1与Henan Sq1,序列分析表明2株病毒均为基因1型狂犬病毒,2株病毒的N基因与G基因核苷酸的同源性分别为99.3%和98.9%,氨基酸的同源性分别为98.7%和98.4%.2株病毒与CTN疫苗株同源性较高,N基因与G基因的核苷酸同源性分别为89.1%和85.6%～85.7%,氨基酸同源性分别为97.6%～98.0%和92.3%.与已知的基因1型狂犬病毒相比,2株病毒与印度尼西亚从犬中分离到的2株病毒同源性高,N基因与G基因核苷酸同源性分别为92.1%～93.2%和91.9%～92.1%,氨基酸同源性分别为97.5%～98.6%和96.0%～96.2%.Henan Sq1株病毒在糖蛋白关键的毒力位点333位由W替换了R.系统发育分析表明Henan Hb1与Henan Sq1与印度尼西亚株、疫苗株CTN、中国分离株,以及泰国与马来西亚分离株进化关系近,而与疫苗株3aG、PV、ERA及攻击毒CVS株等进化关系较远.结论 2株狂犬病毒是基因1型狂犬病毒,但无论是N基因还是G基因的核苷酸序列,以及推导出来的氨基酸序列与已知的1型狂犬病毒株及疫苗株均有一定的差异.
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中国流行的狂犬病病毒时空进化分析
本研究对1931～2009年间分离于中国20个省区的167株狂犬病病毒的N基因序列进行进化分析,以探讨中国狂犬病病毒株的基因分型和分组情况、时间和空间的动态进化.结果显示:从中国分离的毒株都属于基因1型狂犬病病毒,可以分为2个进化分支共计8个组,分支I包括1～4组,分支Ⅱ包括5～8组;选择压力分析表明中国狂犬病病毒处于较强的净化选择约束下,狂犬病病毒N基因中的核苷酸突变主要是同义突变;运用贝叶斯中的马尔科夫链的蒙特卡洛方法估计中国狂犬病病毒N基因核苷酸的平均碱基替代率为4×10-4替代/位点/年,共同祖先出现的时间不超过2000年前;迁移分析表明中国狂犬病病毒株存在跨地域传播.
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贵州省25株狂犬病病毒核蛋白基因序列分析
分析贵州省25株狂犬病病毒的核蛋白基因(N基因)序列,探讨贵州省狂犬病流行特征与狂犬病病毒变异情况.以RT-nested PCR检测来自贵州省2005年至2010年不同地区的病人脑组织、病人唾液以及犬脑组织标本狂犬病病毒RNA,经测序与拼接后得到25条N基因全长序列,采用生物信息学软件对N基因序列进行分析.25株狂犬病病毒核蛋白在核苷酸及氨基酸水平上彼此的同源性分别为89.3％～100％和98.％～100％0;与国内其他省已发表基因1型狂犬病病毒核苷酸和氨基酸序列同源性分别为88％～99.1％和88％～99.7％,与已知的基因1型狂犬病病毒比较,25株病毒核蛋白氨基酸序列发生了若干位点的取代.进化树分析显示,同一地区内与相邻地区,以及同一时间段与相邻时间段内狂犬病病毒N基因进化亲缘关系相近.25株贵州省狂犬病病毒流行毒株均属基因1型,其核蛋白在基因的核苷酸及推导的氨基酸水平上均有变异,且这些变异具有地域和时间分布特性.
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中国19个狂犬病病毒街毒分离株N基因的序列分析
测定了30年来从不同动物中分离的19个中国狂犬病病毒街毒株N基因的部分核酸序列,并对其核苷酸差异做了比较分析.可将中国狂犬病病毒街毒株分为4个组群,各组间的同源性为83.45%～88.62%.除广西地区分离的狂犬病病毒街毒株彼此差异较大外,其余街毒株的地理分布与其N基因核酸序列差异的距离是密切相关的,基本上可按其地理分布分为东、西二大组.
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猪传染性胃肠炎病毒n基因的原核表达及重组蛋白的免疫活性分析
猪传染性胃肠炎(transmissible gastroenteritis,TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)引起的一种急性、高度接触性传染病,以呕吐、水样腹泻、脱水和对2周龄以内仔猪高度致死率为特征[1].
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2016年盐城地区麻疹病毒分子分型及血凝素蛋白基因特征分析
目的 鉴定2016年流行于盐城地区的麻疹野病毒的基因型别,并对血凝素蛋白基因进行分子进化特征分析.方法 通过实时荧光RT-PCR方法对2016年盐城市疑似麻疹病例咽拭子标本进行核酸检测,对麻疹病毒核酸阳性标本RT-PCR扩增核蛋白、血凝素蛋白基因并测序,采用相应的生物信息软件对核苷酸及氨基酸序列比对及基因亲缘关系进化特征分析.结果 2016年盐城地区麻疹病毒经基因型分型为H1a基因亚型和D8基因型.5株H1a代表株与江西代表株(KJ136545)聚集成簇形成独立的进化小分支,属H1a-1进化基因群分支;7株D8代表株与2009年美国代表株(JN635404)聚集成簇,属D8-3-2小分支基因群毒株.与疫苗株沪S191相比,盐城地区5株H1a基因亚型代表株240位氨基酸发生了S240 N的变异,丢失了238位N-连接的糖基化位点,7株D8基因型代表株未发生N-糖基化位点的变化.结论 2016年盐城地区麻疹病毒流行株主要为中国本土H1a优势基因亚型和D8输入基因型;除5株H1a基因亚型代表株丢失了238位N-连接的糖基化位点,盐城地区12株麻疹病毒HA基因大部分重要中和抗原位点未发生变异.
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贵州省一例犬伤致人患狂犬病的病原学及病毒基因分析
目的 从病原学角度证实贵州省凯里市一起犬伤人致儿童死亡病例为狂犬病所致,了解狂犬病病毒的基因特征.方法 采用dFA实验初步检测犬和患儿脑组织狂犬病病毒抗原,以RT-nested PCR检测狂犬病病毒核酸,测定狂犬病病毒N基因全长序列,根据同源性比较及系统进化树进行分子流行病学分析.结果 dFA与RT-nested PCR检测显示犬脑和人脑组织标本均为狂犬病病毒抗原和核酸阳性.经测序拼接均得到长度为1353 bp的核苷酸序列,同源性分析显示犬脑组织(GZD)和人脑组织(GZH)检出的狂犬病病毒N基因核苷酸与推导的氨基酸同源性均为100％,与我国各省已报道的狂犬病病毒基因1型流行毒株及疫苗株核苷酸和氨基酸序列同源性分别为88.4％～99.6％和98.2％～100％,与我省往年报道的毒株N基因核苷酸和推到的氨基酸同源性高.此外,在与疫苗株的比较中,与CNT株的核苷酸和氨基酸同源性高.进化树分析显示犬脑和人脑组织标本狂犬病病毒N基因亲缘进化关很近,同属于基因1型狂犬病病毒.结论 从病原学和病毒分子生物学证实了贵州省一起犬伤人致儿童死亡病例为狂犬病所致,其病原为狂犬病病毒基因1型,与疫苗毒株中的CNT毒株的亲缘进化关系近,该起病例可能为我省境内传播,因此,应加强我省狂犬病疫区的防制工作.
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犬瘟热病毒分子生物学研究进展
犬瘟热病是由犬瘟热病毒(CDV)感染犬和其他食肉动物的多发性、致死性传染病.CDV属于副黏病毒科麻疹病毒属有囊膜的负链线性RNA病毒,基因组长约16*!kb.基因组中包括6个非重叠基因区.它们的编码基因按3′～5′端顺序依次为N-P-M-F-H-L系列.新研究表明CDV两个糖蛋白(H,F)是宿主免疫系统的主要目的抗原,产生中和抗体的重要抗原之一.N蛋白是保守性较强的免疫原性蛋白,此外N蛋白上含有T细胞表位.H, F和N蛋白在犬瘟热的免疫预防方面起重要作用.
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新疆伊犁地区驴脑组织亨德拉病毒感染情况调查
目的 调查新疆伊犁地区草原放养驴群中亨德拉病毒(Hendra virus,HeV)中枢感染的流行情况.方法 采用一步法实时荧光定量RT-PCR检测病毒核酸片段的方法对采自新疆伊犁地区草原放养、未接种 HeV疫苗的65例驴脑组织进行 HeV核蛋白(N)基因片段检测.结果 65例驴脑组织成功进行一步法实时荧光定量RT-PCR检测,未检出阳性样本.结论 目前尚未发现我国新疆伊犁地区放养驴中存在 HeV中枢神经感染的证据,提示该地区出现 HeV感染流行的可能性不大.
关键词： 亨德拉病毒 N基因 一步法荧光定量RT-PCR 新疆伊犁地区 驴 -
中国狂犬病病毒遗传多样性分析
目的 分析中国狂犬病病毒(RV)的遗传多样性,为我国狂犬病的预防提供理论依据.方法 采用RT-PCR技术扩增26株RV N基因,并进行测序,与GenBank登录的序列进行比对,构建进化树,分析RV的基因分型和分组情况以及时间和空间的动态进化.结果 中国RV分为2个大的进化分支(8组),分支Ⅰ包括1～4组,分支Ⅱ包括5～8组,组内核苷酸同源性≥93.2%,氨基酸同源性≥94.3%;组间核苷酸差异性≥8.0%,氨基酸差异性≥1.7%;运用贝叶斯中的马尔科夫链的蒙特卡洛方法,估计中国RV N基因核苷酸的平均碱基替代率为1.408 9×10-4取代/位点·年,共同祖先出现在公元968年.结论 中国狂犬病病毒株均属于基因1型狂犬病病毒,存在跨地域、跨宿主传播;我国分支Ⅰ狂犬病病毒株与泰国、越南、菲律宾、印度尼西亚、马来西亚等东南亚国家分离的狂犬病病毒株起源相同;分支Ⅱ的毒株在全球分布.
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新分离5株狂犬病病毒街毒株N和G基因的序列分析
目的 分析我国新分离的5株狂犬病病毒(RV)街毒株基因序列及分子流行病学状况.方法 采用RT-PCR法从疑似狂犬的犬脑组织内获得N和G基因 cDNA的全序列并进行测序,将所得结果与已发表的国内外代表性毒株相应基因进行核苷酸和推导氨基酸序列比较.结果 5株均含有完整N基因序列,3株含有完整G基因序列.与国内外发表的部分毒株比较,5株街毒N基因的核苷酸同源性在98.1%～99.9%之间,推导氨基酸同源性在99.5%～100%之间.将5株街毒与人用疫苗株3aG、PV株的N基因进行比较,核苷酸同源性在86.2%～86.7%之间,氨基酸同源性在95.1%～95.5%之间;而与人用疫苗株CTN比较,核苷酸同源性在89.4%～89.6%之间,氨基酸同源性在98.2%～98.6%之间.3株街毒G基因的核苷酸同源性在98.5%～99.4%之间,推导氨基酸同源性在99.6%～100%之间.将3株街毒与人用疫苗株aG、PV和兽用疫苗株ERA的G基因进行比较,核苷酸同源性在82.8%～83.1%之间,氨基酸同源性在88.0%～90.1%之间;而与人用疫苗株CTN比较,核苷酸同源性在86.7%～87.1%之间,氨基酸同源性均为92.0%.结论 新分离街毒株基因未发生较大变异,与CTN的同源性高于与aG株和PV株.
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河南省9株狂犬病毒的N基因序列分析
目的 分析河南省9株狂犬病毒的核蛋白基因序列,探讨狂犬病毒流行株毒力与致病性的可能变异.方法 以RT-nested-PCR扩增9株2006年12月分离于河南省信阳市的狂犬病毒街株,经纯化、克隆、测序后获得9条N基因全长序列,采用生物信息学软件对N基因序列进行分析.结果 9株狂犬病毒核蛋白在核苷酸及氨基酸水平上彼此的同源性分别为97.5%～99.3%和98.4%～99.8%;病毒与CTN疫苗的核苷酸序列同源性高,为88.9%～90.1%,氨基酸序列同源性为97.6%～98.0%;与其他疫苗株相比,9株病毒与其核苷酸及氨基酸同源性范围分别为84.4%～87.9%和94.2%～97.3%;与已知的基因1型狂犬病毒比较,9株病毒核蛋白氨基酸序列发生了若干位点的取代.结论 9株河南省狂犬病毒流行株均属基因1型,其核蛋白在基因的核苷酸及推导的氨基酸水平上均有变异,这些变异可能影响疫苗对流行株所致狂犬病的保护效果.
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湖南省1979-2010年狂犬病流行特征及其毒株遗传关系分析
目的 分析1979-2010年湖南省狂犬病流行特征及分离病毒N基因特征,探讨疫情波动影响因素及病毒进化情况.方法 采用回顾性与描述性流行病学方法对湖南省32年来,狂犬病疫情数据进行统计分析;利用PubMed-Entrez Search程序建立GenBank、EMBL报道的湖南省境内分离的狂犬病毒N基因序列本地数据库,应用生物信息学方法分析病毒N基因特征与变异情况,参考贵州与广西2个高发省份分离的部分狂犬病毒及国内疫苗株CTN-1-V N基因序列,运用Clustal W 1.83软件进行多重序列比对,运用MEGA 5.0.4软件构建N基因系统进化树,分析湖南省分离毒株与贵州、广西分离株亲缘关系及病毒遗传特征差异.结果 32年来,湖南省累计报告狂犬病病例12 576例,总发病率0.69/10万;全省124个县(市、区)均有疫情报告;病例集中于湘南与湘中地区;7～10月份发病数较多(43.23％);农民所占比例大(64.35％).58株毒株N基因全序列平均GC含量为44.49％,AT含量为55.51％,平均单链分子量为409.7 KDa;氨基酸组成含量高的为亮氨酸(Leu),含量低的为色氨酸(Trp);58株毒株与贵州、广西及国内疫苗株有较近亲缘关系;58株病毒全部属于狂犬病毒基因Ⅰ型.结论 32年来,湖南省狂犬病疫情存在较大波动;所分离的58株毒株遗传较稳定,未发生关键性变异.
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尼帕病毒巢式RT-PCR方法的建立和初步应用
目的 建立灵敏、特异的检测尼帕病毒的巢式RT-PCR方法.方法 根据GenBank公布的尼帕病毒N基因序列,设计2对特异性引物(外引物和内引物),建立巢式RT-PCR方法,优化反应体系,测定特异性和灵敏度,并进行临床样品的检测.结果 该方法扩增的片段序列与源序列同源性均为100％.特异性试验结果表明本试验设计的内外侧引物不能从新城疫病毒、牛瘟病毒和日本乙型脑炎病毒中扩增出条带.敏感性试验结果表明,该方法低能检测出的标准模板RNA浓度为39 fg/μL.100份临床样品检测结果全部为阴性.结论 初步建立了快速、灵敏、特异的检测尼帕病毒N基因的巢式RT PCR方法,可用于动物疫病监测和检验检疫等领域.
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新疆羊狂犬病病毒的鉴定及N基因序列分析
目的 诊断疑似羊狂犬病病例并分析其病原分子N基因遗传进化关系.方法 采集新疆阿勒泰地区疑似狂犬病羊脑组织,以狂犬病病毒特异性目的基因(N基因)RT-PCR扩增和序列测定进行病毒鉴定;以DNAStar-Lasergene.v7.1软件拼接测定序列,应用BLAST软件分析N基因的遗传进化关系.结果 显示本研究鉴定的狂犬病毒阳性并获得了病毒全基因序列,建立了其N基因的遗传进化关系树,确定疑似的羊狂犬病病毒与狂犬病病毒基因I型俄罗斯C群的遗传关系较近.结论 应用RT-PCR方法对羊源狂犬病进行实验室诊断,获得该病原全基因序列,明确了新疆狂犬病病原和流行地域分布,为羊狂犬病毒分子流行病学研究奠定基础.
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牛冠状病毒N基因的原核表达及初步应用
目的 获得牛冠状病毒N基因的全长序列,实现N基因在大肠杆菌中的高效表达,并进行初步应用.方法 根据已发表的牛冠状病毒Mebus株的序列设计引物,对BCV-DQ株进行RT-PCR扩增、克隆和测序;将该基因插入到原核表达载体pET-30a (+)上进行原核表达,SDS-PAGE 和Western blot检测;用纯化的重组N蛋白作为包被抗原,建立ELISA检测方法,对部分临床样本进行检测.结果 BCV-DQ株N基因全长1 347bp,与GenBank已发表的6株BCV的N基因相比较,核苷酸同源性98.3%以上.构建的重组质粒pET-N能表达出一条大小约为60 ku的蛋白,且能与鼠抗BCV血清发生特异性反应.用建立的ELISA方法对黑龙江不同地区送检的共256份牛血清样品进行检测,结果阳性率65.23%,与病毒中和试验的符合率达95.31%.结论 BCV N基因保守性很高,并在原核表达系统中获得了高效表达,其表达产物具有良好的免疫反应原性.临床检测结果表明N蛋白可作为诊断抗原用于牛冠状病毒病的流行病学调查.
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福建省狂犬病毒的N基因序列分析
目的 了解福建省狂犬病毒流行毒株的基因分型和遗传进化关系,以及流行毒株与疫苗株在N基因核苷酸和氨基酸水平的差异.方法 采集福建省不同时间、不同地区的犬脑组织标本共89份,通过RT-nested-PCR扩增、纯化、克隆、测序,获得19条包含N基因全长的序列,采用生物学软件进行序列整理分析.结果 根据N基因核苷酸和推导的氨基酸的同源性,把福建省已知狂犬病毒分为3个群组,群组间具有显著的地域分布特征,各群组内部N基因核苷酸和氨基酸同源性分别在99.7%~100%和98.9%~100%之间,群组间N基因核苷酸和氨基酸同源性在86.4%~89.3%和95.3%~98.4%之间.福建省狂犬病毒的流行毒株与目前使用的各种疫苗株N基因序列同源性在86.5%~98.9%之间.结论 福建省境内存在表观健康犬携带狂犬病毒现象,福建省已知狂犬病毒流行毒株均属于基因I型,可分为3个群组.从N基因序列的分析上看,我省目前使用疫苗能有效地保护流行毒株的感染.
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盐城市狂犬病毒核蛋白及糖蛋白基因序列分析
目的 对江苏省盐城市狂犬病毒核蛋白及糖蛋白的基因进行遗传学分析,揭示流行于该地区的狂犬病毒与人用及兽用狂犬病疫苗株间的差异.方法 以直接免疫荧光法检测犬脑标本,用阳性犬脑组织悬液接种鼠脑分离病毒.以RT-PCR法扩增病毒核蛋白及糖蛋白全基因片段,克隆测序后进行遗传学分析.结果 从58份犬脑中发现两份样品狂犬病毒抗原阳性,分别命名为Jiangsu Yc87与Jiangsu Yc88.从两份阳性样品均扩增到全N基因与G基因序列.阳性犬脑组织接种乳鼠后,从Jiangsu Yc88样品分离到狂犬病毒.分析发现两株病毒均为基因1型狂犬病毒,两株病毒间N基因与G基因的核苷酸及氨基酸的同源性分别为99.8%和99.7%,氨基酸的同源性分别为99.3%和98.8%.与已知的狂犬病毒相比,两株病毒与我国宁夏、河南、湖南、印度尼西亚病毒株的同源性较高,N基因的核苷酸及氨基酸同源性分别为86.3%～98.7%和95.4%～99.8%,G基因核苷酸及氨基酸同源性分别为82.1%～92.1%和94.1%～95.7%;Jiangsu Yc87与Jiangsu Yc88N基因的氨基酸序列分别发生了4和2处氨基酸的替换,G基因的氨基酸序列发生了29和26处氨基酸的替换.与当前使用的疫苗株相比,两株病毒与CTN疫苗株同源性较高,N基因与G基因核苷酸同源性分别为90.2%和87.1%～87.3%,氨基酸同源性分别为98.4%和91.7%～92.3%,但G基因膜外区与所有疫苗株无显著差异;N基因的氨基酸序列分别发生了5和6处氨基酸的替换,G基因的氨基酸序列发生了31和28处氨基酸的替换.结论 两株狂犬病毒为基因1型狂犬病毒,其N基因和G基因的核苷酸序列以及推导出来的氨基酸序列与已知的1型狂犬病毒株及疫苗株均有一定的差异.
