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端粒酶核酶真核表达质粒pBBS212Rz的构建与鉴定
目的:构建含人端粒酶RNA(hTR)核酶基因的真核表达质粒pBBS212Rz,为以端粒酶为靶点的基因治疗消化系肿瘤研究奠定基础.方法:将人工合成的端粒酶核酶基因通过基因重组定向克隆插入到真核表达质粒载体pBBS212中.根据260nm的紫外光吸收值计算重组质粒pBBS212Rz浓度.结果:端粒酶核酶基因成功地定向插入了载体pBBS212,经酶切后用聚丙烯凝胶电泳鉴定确认.重组质粒浓度为1.77 g/L.结论:成功构建了含人端粒酶RNA(hTR)核酶基因的真核表达重组质粒pBBS212Rz.
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pcDNA3.1(+)/t-PA真核表达质粒的构建及其在血管内皮细胞中的表达
目的利用基因工程技术克隆人组织纤溶酶原激活物(t-PA)基因并构建一种能在血管内皮细胞(VEC)中高效、安全表达t-PA的pcDNA3.1(+)/t-PA真核表达重组质粒.方法采用高效Trizol试剂快速从胎儿肺组织中提取总RNA,RT-PCR获得t-PA cDNA,并将真核表达质粒pcDNA3.1(+)和t-PA基因片段分别双酶切,将回收的pcDNA3.1(+)大片段(5.0kb)与t-PA基因片段(1.9kb)重组.对pcDNA3.1(+)/t-PA质粒进行酶切鉴定和测序.脂质体介导pcDNA3.1(+)/t-PA转染血管内皮细胞,并用RT-PCR法和ELISA法分别从mRNA水平和蛋白质水平检测t-PA的表达情况.结果成功地从胎儿肺组织中克隆了t-PA基因,并构建了以pcDNA3.1(+)为载体的真核表达质粒载体.pcDNA3.1(+)/t-PA转染血管内皮细胞后,t-PA表达增加,(n=6,P<0.01).结论含t-PA基因真核表达质粒构建成功.
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携带p16基因真核表达质粒载体的构建
p16基因定位于9p21,编码一个16kD的蛋白质,此蛋白质是一种细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)的抑制因子(CDK4I).有研究者发现将全长p16基因的cDNA导入无p16基因的人类胶质瘤细胞中可显著抑制其生长.因此,构建p16真核表达载体,针对恢复p16基因功能的基因治疗策略,将对肿瘤的治疗产生积极的意义.
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癌胚抗原与B-7.1双表达基因疫苗的构建及表达
基因疫苗是把外源基因连接到真核表达质粒载体上,将重组的质粒DNA注射到动物体内,使外源基因在活体内表达,产生的抗原激活机体免疫系统引发免疫反应.DNA疫苗制备简便、安全长效、可组建多价疫苗并兼有预防和治疗作用.癌胚抗原(CEA)有一定的抗原性,可作为诱导肿瘤免疫的有效靶抗原[1].B7.1分子可促进多种抗原诱导的免疫反应[2].我们选择编码人全长CEA和B7.1的cDNA构建共表达质粒载体,并检测其在体内、外的表达,为增强CEA基因疫苗的免疫效果进行研究.