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人血管能抑素canstatin基因的分子克隆
目的:克隆血管能抑素canstatin基因,测定并分析其基因序列.方法:从人胎盘组织中提取总RNA,经逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出canstatin基因,克隆进载体pUCm-T获得重组质粒pUCm-T/canstatin,转化E.coliDH 5α,挑选出阳性克隆,测定基因序列.结果:从人胎盘组织中提取出RNA,10 g/L琼脂糖凝胶电泳显示3条清晰条带,分别对应28 S,18 S,5 S.分光光度计测定总RNA的A260=0.879,A280=0.410,A26:A280=2.095,总RNA浓度为1.8 g/L.RT-PCR扩增产物与预期的目的基因canstatin长度一致.RT-PCR产物与载体pUCm-T连接过夜后,转化E.coliDH5α,在LB平板上生长出蓝色和白色菌落.挑选6个白色菌落做酶切鉴定,其中一个菌落经BamHI酶切后,只出现l条特异性条带,位置与酶切前质粒相近,而经HindⅢ酶切后,出现2条特异性条带,其中l条与酶切前质粒位置相近,另l条与目的基因位置基本一致,证实为阳性克隆.测定该阳性克隆基因序列,结果显示其与Genbank中公布的canstatin基因序列完全一致.结论:成功克隆了canstatin基因,为进一步研究其抗肿瘤作用打下基础.
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乙型肝炎病毒慢性感染者血清中不同类型病毒转录体的检测及其意义
目的:建立针对乙型肝炎病毒(HBV)全长型(fRNA)和顿挫型转录体(trRNA)的血清学检测方法,并探讨其临床应用价值.方法:自患者血清中提取病毒核酸,经PCR及PRT-PCR进行扩增,琼脂糖电泳显示产物,Southem印迹验证反应的特异性.取代表性产物克隆,测序.结果:在HBV慢性携带者的血清中检测到了在上述不同poly(A)位点成熟的病毒RNA.血清中fRNA的检出与e抗原阳性和较强的病毒DNA信号相对应,与转氨酶活性呈正相关,这一血清学指标反映了病毒复制;而trRNA的检出与e抗原阳性和转氨酶活性无关,不象fRNA那样依赖于血清中病毒DNA的量.二者检出率随年龄有不同变化,前者随年龄增加而进行性减低乃至转阴;而后者在10-20岁期间检出率升至80%,以后维持在较高水平.即使在某些表面抗原阴性血清中,也能检测到trRNA和不在上述两个位点成熟的病毒RNA.这些转录体在某些隐源性肝硬变和丙型肝炎患者血清中也存在.结论:病毒转录体的血清学检测有助于确定目前尚不认识的HBV感染期,可用来更准确地区分复制期和非复制期以及检出隐匿性HBV感染.
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带有T细胞标记的多发性骨髓瘤一例
患者,女,67岁,因反复胸、腰、背部疼痛2个月,加重1个月于2001年7月23日入院.胸、腰、背痛十分严重,活动受限,平卧时呼吸短促,有低热和盗汗.在当地医院发现左锁骨上窝淋巴结肿大,经病理活检诊断为慢性淋巴结炎,未见转移瘤或结核灶.骨髓有"分类不明大细胞".血浆蛋白电泳显示α、β球蛋白增高,γ球蛋白降低,尿本-周蛋白(-).
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人转化生长因子-β1基因克隆、测序及真核表达载体的构建
目的 克隆人转化生长因子-β1(TGF-β1)基因编码区cDNA序列,构建并鉴定TGF-β1真核表达载体.方法 设计含有EcoRⅠ和XholⅠ酶切位点的TGF-β1cDNA引物,利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法,以人白细胞mRNA为模版,扩增TGF-猹1基因,纯化PCR产物,TA克隆,双酶切与pcDNA3质粒表达载体连接,转化感受态大肠杆菌JM109,酶切鉴定阳性重组子,并进行序列测定.结果 琼脂糖凝胶电泳显示,用双酶切后形成分子量1.2kb的条带,符合物理图谱,表明表达载体构建成功,序列测定结果与预测结果完全一致.结论 成功克隆了TGF-猹1基因,并成功地构建了真核表达载体pcDNA3-TGF-β1.
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鼠伤寒沙门氏菌耐药质粒的研究
1982年10~11月在上海暴发流行期收集的45株鼠伤寒沙门氏菌流行株中,对氨苄青霉素、氯霉素、四环素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、氧哌嗪青霉素和复方SMz-TMP的耐药者占73.3%,对5种或5种以上抗菌药物耐物药者占93.7%;而同期从带菌者中分离的9株鼠伤寒沙门氏菌非流行株中仅工株为多重耐药株.接合转移和转化试验证明,细菌的多重耐药性乃耐药(R)质粒(抗性或耐药质粒)所介导,25%在五质粒可将其耐药性转移给大肠杆菌KRif/12,转移频率为10-4~10-6.琼脂糖凝胶电泳显示:流行株的质粒谱相似+均有5~6个质粒带,其中大质粒与多重耐药性有关;而非流行株仅有一个质粒带.
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霍乱弧菌小川型在人胆汁中存活和变异及其血清型别转换的分子生物学研究
[目的]追踪观察霍乱弧菌小川型流行株在离体人胆汁样本中的存活和L型变异状况;探索小川型在其抗体作用下对转换为稻叶型的发生频度和其对Ctx基因的影响;为改善当前霍乱防治工作提供实验依据.[方法]对保存染菌胆汁样本进行细菌和L型测数、鉴定.以抗体软琼脂法诱导血清型别转换;以蔗糖半固体平板检测细菌趋化性.用PCR和测序法比较转型前后的肠毒素基因改变.[结果]在2份染菌人胆汁中,发现1份存活达22年,其总菌数为2.5×10 3cfu/ml,其中L型构成比为32%.3株小川型流行株在人胆汁及抗体作用下,转换为稻叶型发生频度为2%~6%;酶切电泳显示转型前后其Ctx基因图型相似,经CtxAB测序后,差异7Nt(7/1226),显示有一定的变异.3株转型前后细菌的化学趋化性未见显著改变.[结论]为霍乱弧菌在某些患者胆囊中长期存活而成为慢性带菌者提供了实验依据.
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半胱天冬酶与缺氧缺血性脑损伤
凋亡作为细胞死亡的一种重要形式,在生物和医学领域被广泛关注.在形态学和生化学上,凋亡具有显著的有别于坏死的特征性变化[1]:核染色质浓缩、片段化,细胞器收缩,细胞体积减小,凋亡小体形成以及凝胶电泳显示DNA梯带等.研究发现,凋亡受多种基因的调控,有多种细胞因子参与,其中半胱天冬酶(caspase)家族在凋亡的发生、发展过程中有重要的作用,倍受注目.随着对caspase的深入研究将有助于对凋亡发生机制的认识的深化,现就近年来对caspase的研究作一综述.
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双荧光素染色检测5-氟尿嘧啶及羟基喜树碱诱导的肝癌SMMC-7721细胞凋亡的研究
我们用5-氟尿嘧啶(5-Fu)、羟基喜树碱(HCPT)在体外诱导人肝癌细胞SMMC-7721 产生凋亡,并用双荧光染料吖啶橙/溴乙锭(AO/EB)染色结合DNA电泳法进行观察,结果报道如下。 一、材料与方法 将1×108/L SSC-7721细胞(中国科学院上海细胞学研究所)接种于含体积分数为10%小牛血清的RPMI 1640培养液中,于37 ℃,体积分数5%CO2培养24 h,细胞铺满瓶底,呈对数生长时加入5-Fu、HCPT使二者终浓度分别为75 mg/L、1 mg/L,再继续孵育,分别于6、1 2、24、48 h观察结果。 细胞孵育至特定时间,以质量分数为0.125%胰酶消化细胞3~5 min,细胞脱壁后加入原培养液洗刷细胞,2 000 r/min离心5 min,弃上清,加入500 μl培养液,配成细胞悬液,再加入实验用AO/EB溶液20 μl,混匀,置1滴于载玻片上,荧光显微镜下观察200个细胞,分别计数早期凋亡细胞(VA)、晚期凋亡(NVA)、活细胞(VN)及非凋亡的死亡细胞(NVN),计算凋亡率。 凋亡率=(VA+NVA)/(VA+NVA+VN+NVN)×100% 收集细胞,磷酸盐缓冲液洗涤2遍,低速离心5 min后弃上清。加入抽提缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl ph 8.0、20 mg/L胰RNA酶、0.5%SDS),37?℃ 1?h。加入蛋白酶K至终浓度100 mg/L,55?℃ 3?h,每隔20~30 min摇动1次至室温,按酚/氯仿法抽提DNA。1%琼脂糖凝胶电泳,紫外投射仪上观察并摄片。 二、结果 5-Fu、HCPT均能诱导SMMC-7721细胞产生凋亡,且随时间延长,其凋亡率在增加,在加药后6、12、24、48 h用AO/EB染色法检测,细胞凋亡率5-Fu组分别为19.6%、 23.8%、35.4%、38.7%,HCPT组分别为21.2%、26.5%、37.1%、42.6% ,而对照组分别为2.0%、2.8%、3.2%、3.5%。两种药物在相同时间诱导SMMC-7721凋亡的百分率差异无显著性(P> 0.05 ),而两者诱导细胞凋亡的百分率与对照组比较,差异均有显著性(P<0.01。DNA电泳显示两种药物诱导6 h后均可见DNA裂解成180~250 bp整数倍的小片段,呈典型的梯形条带,以4 h为明显,而对照组无此表现。 三、讨论 本研究结果显示,SMMC-7721细胞经小剂量5-Fu、HCPT作用后,DNA电泳显示出典型的梯形条带。在琼脂糖凝胶电泳中DNA片段呈梯形表现,是DNA链被裂解成核小体间长度片段的特异性表现。从而提示小剂量的5-Fu、HCPT具有诱导SMMC-7721细胞产生凋亡的作用,可作为细胞凋亡诱导剂用于肝癌治疗。