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高耐庆大霉素粪肠球菌质粒接合转移试验的方法探讨
目的筛选出较好的高耐庆大霉素粪肠球菌质粒接合转移的试验方法. 方法使用NCCLS推荐的琼脂稀释法筛选临床分离36株高耐庆大霉素(HLGR)粪肠球菌,质粒接合转移试验采用肉汤接合法和滤膜接合法. 结果 36株粪肠球菌用普通肉汤(NB)、普通肉汤加马血清(NBH)、心脑浸液(BHI)、心脑浸液加马血清(BHIH)4种培养基作为接合前及接合过程培养介质,HLGR接合转移率分别为50%、75%、89%、89%,滤膜接合法转移率达到100%,所形成的HLGR接合子也不同程度的获得了对其他抗菌药物的耐药性. 结论采用BHI或 BHI加马血清的肉汤培养基接合转移效果较好,结果一致,滤膜接合法可获得更高的转移通过率.
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大肠杆菌-链霉菌穿梭型BAC载体的构建及功能验证
目的 构建可由大肠杆菌接合转移至链霉菌并整合至其基因组的穿梭型BAC载体,以实现大片段基因簇在大肠杆菌中完成遗传操作后,转移至链霉菌中进行异源表达.方法 从原始B载体pBeloBAC11出发,利用pKD46介导的Red同源重组技术,将一段包含接合转移元件oriT、定点整合元件attp-int和安普霉素抗性基因Am的DNA片段替换其上的氯霉素抗性基因,该DNA片段通过PCR扩增得到,两端为待替换氯霉素抗性基因上下游55 bp的同源臂,替换后的载体通过酶切连入链霉菌组成型启动子ermEP1P2和绿色荧光蛋白(GFP)基因以验证其接合和整合功能.结果 原载体pBeloBACll的氯霉素抗性基因被成功替换,得到载体pBTIBAC1,利用该载体可在变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)TK24和1326中表达GFP,在pBTIBAC1上插入新的多克隆位点(MCS)后得到载体pBTIBAC11.结论 pBTIB AC11载体可通过接合转移携带外源基因片段进入链霉菌并整合至其基因组中,同时保留了原有BAC载体的功能元件,为大片段在链霉菌中的并源表达奠定了基础.
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纳米二氧化钛对多药耐药质粒RP4接合转移的影响
目的 探讨纳米TiO2对多药耐药质粒RP4接合转移的影响及规律.方法 供体菌为Escherichia coli HB101 (RP4),受体菌为具有耐利福平的E.coli K12Rif,保持供、受体菌液浓度比例为1∶1,在一定条件下静止接合一定时间后,利用含有不同抗生素的LB琼脂培养基选择平板计数接合子数量并计算接合转移频率.结果 纳米TiO2可促进RP4的接合转移,该促进作用与纳米TiO2浓度、接合菌液密度、接合温度以及接合时间有关,与接合体系pH值无关.结论 在一定条件下,纳米TiO2可促进质粒的接合转移,从而加重抗生素耐药的问题.
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纳米氧化铝促进多重耐药质粒RP4接合转移机制的初步研究
目的 探讨纳米氧化铝(Al<,2>O<,3>)对细菌抗氧化系统和接合基因转录活性的影响,阐明纳米Al<,2>O<,3>促进多重耐药质粒RP4接合转移的机制.方法 接合供体菌为E.coli HB101(RP4),受体菌为沙门菌50312(Salmonella aberdeenKauffmann 50312 str<'R>),供、受体菌液均为10<'9> cfu/ml(浓度比为1:3),25℃条件下静止接合8 h,检测纳米Al<,2>O<,3>对细菌抗氧化系统和接合基因转录活性的影响.结果 纳米Al<,2>O<,3>干预后,细菌产生的游离羟自由基(OH·)随着纳米Al<,2>O<,3>浓度的升高而上升,5和50 mmol/L组与对照组相比较,细菌的抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽还原酶(GR)的活力都明显增加;TrbBp和TrfAp转录活性也升高,差异均具有统计学意义(P<0.05).结论 纳米Al<,2>O<,3>促进RP4结合转移的机制可能是,纳米Al<,2>O<,3>作用后,促进了接合基因表达;同时也对细菌产生损伤,影响细菌抗氧化系统.
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纳米氧化铝在多重耐药质粒RP4接合转移过程中对细菌形态学的影响
目的 探讨纳米氧化铝(平均粒径为20nm)对液相条件下多重耐药质粒RP4接合转移的影响,并从形态学角度初步探讨其影响机制.方法 接合供体菌为大肠杆菌HB101(RP4),受体菌为Salmonella aberdeen Kauffmann 50312(strR),供、受体菌液均为109cfu/ml(浓度比为1:3),纳米Al2O3浓度分别为0.005、0.05、0、5、5、50mmol/L,25℃静止接合8h后计算转接合子数,然后采用透射电镜和激光扫描共聚焦显微镜进行形态学研究.结果 RP4的接合转移随着纳米Al2O3浓度的升高具有上升趋势.5mmol/L和50mmol/L纳米Al2O3组接合率分别为空白对照组的150倍和40倍,差异均有统计学意义.透射电镜观察结果表明,空白对照组只能观察到单个供、受体菌接合,5mmol/L和50mmol/L纳米Al2O3组能观察到多个细菌同时发生接合的情况;50mmol/LAl2O3组一些细菌观察不到完整的细胞膜结构,该损伤可能是引起50mmol/L纳米Al2O3组接合率低于5mmol/L纳米Al2O3组的原因.激光扫描共聚焦显微镜观察结果提示纳米Al2O3能损伤细菌的细胞膜,细胞膜的损伤程度与进入细菌的纳米Al20,的浓度呈正相关.结论 纳米Al2O3,能够促进接合子的产生,其影响机制可能是因为纳米Al2O3能够改变细胞膜通透性,间接影响接合过程,或者直接促进接合基因的表达所致.
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微生物聚集体形态对多重耐药质粒接合转移的影响
目的 研究水污染控制系统中微生物聚集体形态对多重耐药质粒接合转移的影响,为控制耐药基因在水环境中的传播提供科学依据.方法 向运行稳定的颗粒污泥序批式反应器(granular sequencing batch reactor,GSBR)中投加具有利福平抗性且携带RP4质粒的大肠杆菌K12[E.coli K12(RP4) Rif],将系统中的污泥按照粒径划分为4个区间,分别用定量PCR方法对污泥中总细菌16S rDNA和耐药质粒RP4进行定量,从而得到不同粒径区间的接合转移比例;同时监测GSBR中NH4+-N、CODCr的去除效率和污泥浓度(MLSS),以评价GSBR运行效能.结果 投加供体菌后,系统中的供体菌所占比例在2d内出现急剧下降,此后3～5d,RP4所占比例一直稳定在10-7～ 10-6.从投加供体菌的第7天开始,粒径大于0.9mm的微生物聚集体中无法检测出RP4;粒径范围在0.18～0.45 mm、0.46～0.9 mm的微生物聚集体中的RP4质粒在投加后的第11天消失;而粒径小于0.18mm的絮状污泥中的RP4在投加供体菌后第19天消失.RP4在不同粒径微生物聚集体中的接合转移率明显不同,随着粒径的增大而降低.系统中投加供体菌后CODCr、NH4+-N的去除率均明显下降;污泥浓度(MLSS)从4855 mg/L降至3168 mg/L.结论 实验过程中微生物聚集体的形态对耐药质粒RP4的接合转移有明显影响,粒径越大其接合转移率越低;且在投加供体菌初期,反应器NH4+-N、CODCr的去除能力下降明显,供体菌的投加也使污泥浓度的MLSS下降.
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纳米氧化铝对多重耐药质粒RP4接合转移影响
目的 探讨纳米Al2O3(平均粒径20 mm)对液相接合条件下多重耐药质粒RP4接合转移的影响及其规律.方法 接合供体菌为大肠埃希菌(Escherichia coli)-HBl01(RP4),受体菌为Salmonella aberdeen Kauffmann50312(strR),保持供、受体菌液浓度比例为1:3,25℃静止接合相应时间后,计算转接合子数.结果 纳米Al2O3可影响RP4的接合转移,并主要表现为促进,该促进作用与接合菌液和纳米材料的浓度有关.接合菌浓度为106～108cfu/ml时,5 mmol/L Al2O3作用8 h后对接合的促进作用明显,与相应空白对照组相比转接合子数分别增加100～400倍;50 mmoVL Al2O3,只有当接合菌浓度约为108cfu/ml时才能非常显著地提高接合率;而接合菌液浓度降低至106cfu/ml.和107cfu/ml时,0.5 mmol/l Al2O3组接合率则均显著高于空白对照组.接合菌浓度约为105cfu/ml时,延长接合时间至90 h,0.5 mmol/L Al2O3组不仅能显著提高转接合子数,而且还能缩短接合子出现的时间.5 mmol/L Al2O3组始终未观察到转接合子产生.结论 在一定条件下,纳米材料可促进质粒在液相中的接合转移,从而可能引发纳米材料的水环境安全问题.
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山梨糖脱氢酶基因在酮古龙酸菌中的过表达
目的 在酮古龙酸菌中克隆并过表达山梨糖脱氢酶基因,以便提高单菌发酵产2-酮基-L-古龙酸的能力.方法 从酮古龙酸菌DSM4025基因组中克隆获得山梨糖脱氢酶基因(sorbose dehydrogenase,sdh),酶切连接到含有双亲本接合转移关键基因即可移动基因(mobilization,mob)的pBBR1MCS-2质粒上,构建pBBR1 MCS-2-sdh重组质粒;再将pBBR1 MCS-2、pBBR1MCS-2-sdh分别转入供体菌大肠杆菌(Esche—chiacoli,E coli)S17-1中,以酮古龙酸菌(Ketogulonigenium sp.) Rif-B-003为受体菌进行双亲本接合转移.挑取利福霉素(Rifamycin,Rif)和卡那霉素双抗平板上的接合子进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)、双酶切和测序验证.取重组菌进行摇瓶发酵,用菌体蛋白的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)电泳结果来验证阳性克隆的过表达成功,并检测发酵终点2-酮基-L-古龙酸的产量.结果 构建的重组质粒pBBR1MCS-2-sdh成功转入酮古龙酸菌(Ketogulonigenium sp.)Rif-B-003中,SDS-PAGE检测到,发酵终点菌体蛋白在58 ku(目标蛋白)处条带有加深,重组菌株发酵终点2-酮基-L-古龙酸产量相比于对照菌株酮古龙酸菌(Ketogulonigeniumsp.)Rif-B-003提高了20.86％.结论 山梨糖脱氢酶基因在酮古龙酸菌Rif-B-003里过表达成功,可以提高发酵终点2-酮基-L-古龙酸的产量.
关键词： 酮古龙酸菌 山梨糖脱氢酶 接合转移 2-酮基-L-古龙酸 -
转座因子在肺炎链球菌耐药进化中的作用
肺炎链球菌的耐药决定子由染色体上的转座因子携带,与耐药相关的转座因子和转移的主要方式有:①接合转座子:携带erm(B)、tet(M)和aphA-3等的Tn916-Tn1545家族,通过接合转移;②缺陷转座子:携带mef基因及ABC外排系统的Tn1207.1和mega插入元件,可转化到敏感菌株引起耐药;③复合转座子:由mega插入元件与Tn916整合产生的Tn2009,以转化方式转移.肺炎链球菌通过转座因子获得并传播耐药基因,在其耐药进化中起重要作用.
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伤寒沙门菌耐药质粒体内接合转移的研究
目的 研究伤寒沙门菌耐药质粒pRST98在小鼠体内向大肠埃希菌的接合转移,比较质粒在体内、外接合转移的异同.方法 由于伤寒沙门菌是一种只对人类致病的病原菌,因此将伤寒沙门菌的耐药质粒pRST98导入遗传背景明确的鼠伤寒沙门菌低毒株RIA中,用接合子pRST98/RIA口饲BALB/c小鼠进行体内接合转移.结果 在体外伤寒沙门菌很容易将pRST98转移给大肠埃希菌E.coli K12W1485(F-)Rif-Lac+,该接合子又可将pRST98转移给鼠伤寒沙门菌RIA,但在不同宿主菌中耐药标志的表达有差异.未经人工感染小鼠肠道分离的大肠埃希菌耐药情况严重,口饲pRST98/RIA后出现了部分耐药标志与pRST98耐药谱相同的大肠埃希菌,但有些抗生素的耐药标记未能表达.质粒检测显示体内形成的接合子均含耐药质粒pRST98.结论 伤寒沙门菌耐药质粒pRST98在动物体内、外均可转移给大肠埃希菌,但同一质粒在体内、外大肠埃希菌株中耐药标志表达有差异,即使在同一小鼠体内分离的不同接合子,pRST98/E.coli菌株耐药性亦有不同,显示耐药质粒表达的多样性和复杂性.
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鼠伤寒沙门氏菌耐药质粒的研究
1982年10～11月在上海暴发流行期收集的45株鼠伤寒沙门氏菌流行株中,对氨苄青霉素、氯霉素、四环素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、氧哌嗪青霉素和复方SMz-TMP的耐药者占73.3%,对5种或5种以上抗菌药物耐物药者占93.7%;而同期从带菌者中分离的9株鼠伤寒沙门氏菌非流行株中仅工株为多重耐药株.接合转移和转化试验证明,细菌的多重耐药性乃耐药(R)质粒(抗性或耐药质粒)所介导,25%在五质粒可将其耐药性转移给大肠杆菌KRif/12,转移频率为10-4～10-6.琼脂糖凝胶电泳显示:流行株的质粒谱相似+均有5～6个质粒带,其中大质粒与多重耐药性有关;而非流行株仅有一个质粒带.
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庆大霉素生物合成基因genD1的研究
为研究genD1基因功能,在绛红色小单孢菌GK1101 (△genK)上构建genD1基因缺失工程菌并分析其代谢产物组分变化.首先构建用于genD1基因框内敲除的同源重组质粒pGD14,经接合转移导入绛红色小单孢菌GK1101,经影印筛选获得genD1缺失工程菌GD1989.再发酵并提取其代谢产物,采用质谱法等检测代谢产物.结果表明,工程菌GD1989不再合成庆大霉素C1a和C2b,主要积累庆大霉素A.对工程菌GD1989喂养庆大霉素X2的发酵产物经检测含有庆大霉素C1a、C2b和JI-20A.genD1基因失活导致庆大霉素生物合成代谢流中断,说明genD1基因负责加洛糖胺C-4”位的甲基化.
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微生物质粒研究进展
微生物质粒(plasmid)是独立于微生物染色体外能够自主复制的一种遗传因子,广泛存在于细菌、放线菌和真菌等微生物体内.微生物的某些表型特征,如代谢能力、致病性、共生现象、接合转移和抗生素的抗性作用等往往由质粒控制[1-2].微生物质粒不仅有着重要的生态遗传学意义,而且还可以作为基因工程和分子治疗的重要载体,是分子生物学发展中重要工具和手段.
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南海红树林来源链霉菌Streptomyces sp.OUC6819遗传操作系统的建立
目的 建立南海红树林来源链霉菌Streptomyces sp.OUC6819菌株的遗传转化系统,通过基因阻断方法来研究次级代谢产物的生物合成途径.方法 分别以整合型载体pSET 152和用于同源重组的、包含可能参与大环多烯类化合物生物合成的DNA片段的非复制型cosmid质粒,通过大肠杆菌—链霉菌属间接合转移导入Streptomyces sp.OUC6819之中.结果 通过在接合转移过程中对菌丝体进行超声破碎,成功获得了正确的接合子.采用PCR方法验证了pSET152的导入和目标基因orf1的阻断,进一步对突变株的发酵产物进行了HPLC分析,结果显示突变株丧失了合成大环多烯类化合物的能力.结论 成功建立了基于菌丝体超声破碎的海洋链霉菌遗传转化系统,为对其它基因进行遗传学操作奠定了基础,也为其它不便进行遗传操作的链霉菌提供了参考.
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Avermectin C5-O-甲基转移酶基因的克隆、序列分析及其基因置换
C5-O-甲基转移酶基因(aveD)位于阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)染色体3.4kb BamHI的片段上,通过构建avermectin基因组约3.4kb BamHI片段的亚基因文库,用PCR的方法获得该基因的连锁基因C5-酮基还原酶基因(aveF),并作为探针筛出aveD的克隆子.测序后和GenBank做同源比较,结果一致.构建基因置换穿梭载体pHJ5803(pHZ1358::aveD & Amr),通过ET12567::pUZ8002属间接合转移导入S.avermitilis.放松培养后筛选出双交换重组菌株,并用PCR验证重组菌株的aveD已经破坏,将重组菌株摇瓶发酵液提取avermectin进行色谱质谱联机分析,发现重组菌株仅产生4个组分,与出发菌株的4个B组分完全一致.
关键词： avermectin C5-O-甲基转移酶 基因置换 接合转移 -
黑暗链霉菌中安普霉素生物合成的阻断研究
以黑暗链霉菌Tt-49基因组为模板,利用PCR方法,扩增安普霉素生物合成关键基因aprH～M的上、下游序列,作为同源交换臂,并以温敏复制型质粒pKC1139为基础,构建用于阻断黑暗链霉菌Tt-49中安普霉素生物合成的重组质粒pHM106.质粒经接合转移进入黑暗链霉菌Tt-49,并筛选得到发生同源双交换工程菌,命名为黑暗链霉菌HM106.通过PCR鉴定,证明工程菌HM106中的aprH～M被tetr替换.对工程菌HM106进行发酵产物分析,结果是其发酵效价下降明显,仅为出发菌株的40％左右.采用薄层层析(TLC)对其组分分析,其安普霉素组分消失,因此,初步判断已成功阻断安普霉素的生物合成.
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深海放线菌Marinactinospora thermotolerans SCSIO 00652遗传操作系统的建立
目的 建立深海放线菌Marinactinospora thermotolerans SCSIO 00652菌株的遗传操作系统,通过基因阻断研究次级代谢产物的生物合成途径.方法 在对该菌株的全基因组进行测序的基础上,以基因组序列中编码非核糖体肽合成酶(Nonribosomal peptide synthetase,NRPSs)的基因sl02-A和s63-A为目标基因,利用PCR-targeting介导的基因置换技术构建了重组质粒,在加有3％海盐的培养基上,通过ET12567/pUZ8002属间接合转移导入SCSIO 00652野生菌.结果 接合子通过一代、二代松弛培养都无法得到双交换突变菌株,松弛培养四代后经抗性筛选,双交换率明显提高,PCR分析结果显示s102-A基因和s63-A基因均被成功阻断,HPLC分析结果显示突变株的发酵产物与野生型菌株有一定的差异.结论 成功建立了深海放线菌M.thermotolerans SCSIO 00652的遗传操作系统,为对其它基因进行遗传学操作奠定了基础.
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绛红色小单孢菌G1008接合转移体系的构建
目的 构建绛红色小单孢菌(Micromonospora purpurea)的接合转移体系,并对该体系进行优化.方法 以绛红色小单孢菌G1008染色体DNA为模板,经PCR扩增甲基化酶基因gntK的上下游序列各2000bp左右作为同源交换臂,并将红霉素抗性基因作为筛选标记插入两交换臂之间.以温敏型质粒pKC 1139作为基本载体,构建重组质粒pFD306.借助接合转移技术,将该质粒导入绛红色小单孢菌G1008.结果 经抗性筛选,得到一株阳性菌株,命名为GK1008,经PCR鉴定和测序,验证了重组质粒已整合到染色体上.GK1008菌株对红霉素和安普霉素的抗性均超过500μg/mL.结论 绛红色小单孢菌接合转移体系的构建达到了预期目的,并实现了对该体系的优化,这为其它小单孢菌的分子遗传学操作提供了借鉴.
