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氨甲酰妥布霉素高产菌株的诱变选育
目的筛选氨甲酰妥布霉素高产菌株.方法通过诱变剂和诱变条件的考察,确定佳选育手段,从而筛选到效价高、组分好的优良生产菌株.结果 UV、NTG等诱变方法处理后得一稳定高产菌株,效价为2 182 U·mL-1,为出发菌株的1.3倍.结论 UV、NTG诱变可明显提高菌株产量.
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氨甲酰-妥布霉素产生菌的高产菌株筛选
以黑暗链霉菌Streptomyce tenebrarius 163为出发菌株,应用磁场、磁场复合吖啶橙、耐受氨甲酰-妥布霉素、磁场复合耐受氨甲酰-妥布霉素筛选得到5株高产菌株,经摇瓶发酵复筛后表明,其总效价与氨甲酰-妥布霉素均比出发菌株提高了25%以上.
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单组分妥布霉素产生菌的选育
目的提高妥布霉素产生菌的发酵单位.方法 以黑暗链霉菌UVS-51为出发菌株,采用UV和NTG为诱变剂,结合耐受妥布霉素,运用固体循环诱变筛选高产菌株.结果 获得两株高产稳定变株NS-81和NT-26,这两株菌的摇瓶发酵效价分别比出发菌株提高53%和77%.经薄层层析检验,该两变株的产物仍为单一的氨甲酰妥布霉素.结论 出发菌株经UV和NTG诱变处理后结合耐自身代谢物的驯育,正变率显著提高.通过引入循环诱变筛选的思路,大大缩短的实验周期,有效地提高了诱变育种的工作效率,能在较短时间内选育到理想变株,因此,循环诱变筛选法是一种较好的选育方法.
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黑暗链霉菌原生质体制备、再生及其DNA转化条件的研究
利用CP培养基培养黑暗链霉菌（Streptomyces tenebrarius）9904,采用二级培养即首先在37℃培养48 h,然后按10%的转种量转种于新鲜的培养基中,同时补加2%甘氨酸,28℃培养20 h,收获的菌丝体对溶菌酶敏感。在适宜的酶解条件下可形成4.62×109/mL原生质体,再生率为18%。利用经修饰的质粒DNA转化冻存的原生质体获得成功,转化率为103～104/μgDNA。
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aprK基因敲除的氨甲酰妥布霉素工程菌的构建
以温敏型穿梭质粒pKC1139为基础,克隆安普霉素辛二糖合成酶基因aprK上下游序列作为同源交换臂,构建用于敲除aprK的重组质粒pBK5.pBK5转化E.coli ET12567后经接合转移导入黑暗链霉菌Tt-49,得到单交换菌株ST315.ST315经松弛传代后通过影印培养与PCR筛选得到aprK阻断突变株ST316.ST316发酵效价约1 500 ug/mL,发酵产物经TLC分析,发现安普霉素的生物合成被阻断,得到了一株主要产氨甲酰妥布霉素的工程菌.
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黑暗链霉菌tobS1-C基因缺失突变株的构建
通过敲除妥布霉素生物合成基因tobS1-C,定向选育阿泊拉霉素高产菌株.PCR扩增tobS1-C基因上下游同源序列和红霉素抗性基因ermE,构建穿梭载体pSH6,利用接合转移法转化黑暗链霉菌Tt49,经同源重组,敲除tobS1-C两基因序列,共2 484 bp,获得框内删除突变株黑暗链霉菌T103(△tobS1C).发酵验证表明突变株不再合成妥布霉素,只合成阿泊拉霉素.
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TLC法在妥布霉素中间体检测中的应用
妥布霉素(Tobramycine)为世界临床广泛使用的氨基糖苷类抗生素之一,是美国礼莱公司1967年从黑暗链霉菌(Stepomyces tenebrarius)发酵液中分离到的多组分复合物尼拉霉素(Nebramycine)组分6,由尼拉霉素的主要组分氨基甲酰妥布霉素(Carbamoyl Tobramycine)经碱性水解获得.
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黑暗链霉菌安普霉素生物合成基因aprG的克隆和功能研究
从安普霉素产生菌S.tenebrarius H6总DNA中已克隆得到8.2kb的安普霉素抗性基因连锁片段.对距离抗性基因下游4.5kb的SacI-Sau3AI片段进行测序分析,发现了一个新的891bp开放阅读框架.推测其编码为296个氨基酸的蛋白质.经BLASTX程序分析,没有发现与之同源的基因,是一个新基因,该基因命名为aprG.构建基因阻断穿梭载体pSPU58,经接合转移导入S.tenebrariusH6,筛选单交换阻断变株,并用Southern blot验证阻断变株的aprG已经被破坏.经发酵分析,阻断变株不再合成安普霉素,表明aprG与安普霉素生物合成直接相关.
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多因子处理黑暗链霉菌微型化理性筛选
研究黑暗链霉菌的筛选,揭示其退化的主要表征是出现淡黄色菌落,退化与时间和菌落表征的关系.比较代表四类不同诱变因子NTG、NaNO2、5-Bu和紫外线的处理效果.认为复壮以紫外线温和诱变有效.建立了优质孢子富集法.采用原生质体融合——优质孢子富集法——琼脂块法——固体微型发酵法的复合理性筛选.经摇瓶验证,获得了比出发菌株高出2.5倍的高产菌株.主要成分妥布霉素从52%上升到71%.效果显著,为进一步筛选更加优质高产的菌种提供较为简便的新途径.
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尼拉霉素新组分98-23的研究--分离、结构鉴别及抗菌活性
从黑暗链霉菌(S.tenebrarius)菌种诱变中得到一变株,其发酵产物系单一组分,经大孔离子交换剂、葡聚糖Sephadex离子交换剂提取精制,制得纯品,经IR、MS、1H-NMR、13C-NMR、1H-1H COSY、HOHAHA、HMQC等光谱解析,确定为氨基糖苷类中的新抗生素,化学名为O-3-amino-6-O-(aminocarbonyl)-3-deoxy-α-D-glucopyranosyl-(1→6)-O-[2-amino-2,3-dideoxy-α-D-glucopyranosyl-(1→4)]-2-deoxy-D-streptamine,并测定了部分菌株的MIC数据以及LD50的范围.
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妥布霉素发酵中的二次生长
黑暗链霉菌产生次级代谢产物妥布霉素的过程与供氧条件密切相关。通过对常规发酵的溶氧和残糖变化规律研究发现发酵后期有菌体的二次生长现象，影响了妥布霉素的分泌。采用在发酵后期降低转速的方法抑制发酵过程中黑暗链霉菌的二次生长，延长了妥布霉素的分泌期，使终效价比常规发酵提高了27%。
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单组分妥布霉素工程菌的构建
目的 阻断黑暗链霉菌中安普霉素和氨甲酰妥布霉素的合成,构建主产妥布霉素工程菌.方法 以安普霉素生物合成基因apr为靶标,克隆其上下游序列作为同源交换臂,构建重组质粒pXJ401,利用接合转移技术将其导入黑暗链霉菌Tt-49,获得工程菌TX302,并在此基础上敲除氨甲酰基转移酶基因tobZ,获得工程菌TX308.采用MS法,检测工程菌次级代谢产物的变化.结果 TX302主产氨甲酰妥布霉素,未检测到安普霉素.TX308不再合成氨甲酰妥布霉素,产物只检测到妥布霉素.结论 磷酸变位酶基因apr是安普霉素生物合成的关键基因,敲除后能有效阻断安普霉素的合成,工程菌TX308大量积累妥布霉素,不再合成安普霉素和氨甲酰妥布霉素,具有重要的产业化价值.
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黑暗链霉菌中安普霉素生物合成的阻断研究
以黑暗链霉菌Tt-49基因组为模板,利用PCR方法,扩增安普霉素生物合成关键基因aprH～M的上、下游序列,作为同源交换臂,并以温敏复制型质粒pKC1139为基础,构建用于阻断黑暗链霉菌Tt-49中安普霉素生物合成的重组质粒pHM106.质粒经接合转移进入黑暗链霉菌Tt-49,并筛选得到发生同源双交换工程菌,命名为黑暗链霉菌HM106.通过PCR鉴定,证明工程菌HM106中的aprH～M被tetr替换.对工程菌HM106进行发酵产物分析,结果是其发酵效价下降明显,仅为出发菌株的40％左右.采用薄层层析(TLC)对其组分分析,其安普霉素组分消失,因此,初步判断已成功阻断安普霉素的生物合成.
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氨甲酰妥布霉素高产菌株选育及其发酵特性研究
目的 筛选氨甲酰妥布霉素高产菌株并稳定其发酵效价.方法 以黑暗链霉菌Ts-228为出发菌株.经自然分离,UV诱变结合耐自身代谢产物处理,采用琼脂块法并结合摇瓶发酵来筛选高产菌,获得了Tt-49新菌株.以摇瓶发酵考察生长特性,罐上发酵绘制代谢曲线.结果 效价提高了1.8倍,妥布霉素含量高达68.5%.该菌株生长周期仅4d,传代稳定.种龄18h左右,接种量10%.按照代谢曲线图进行调控,发酵罐的产抗水平达5865u/ml.结论 自然分离与诱变相结合,是黑暗链霉菌选育的有效途径.出发菌株经UV诱变和耐受驯育,发酵效价显著提高.溶氧是妥布霉素发酵生产中的重要调控因子.
