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人pre-miR-145真核表达载体的构建及其对胃癌细胞游走、侵袭活性的影响
目的 构建人微小RNA145(miR-145)前体的真核表达载体,探讨其对胃癌细胞生物学行为的影响.方法 根据人pre-miR-145序列,合成两条互补的寡核苷酸链,退火后连接入pPG-miR-EGFP载体,转化扩增后进行测序鉴定;重组质粒在阳离子脂质体Lipofectamine 2000的介导下,瞬时转染人胃癌细胞株SGC-7901,实时定量聚合酶链反应(PCR)检测细胞中miR-145表达水平,黏附实验和Transwell小室实验检测癌细胞游走、侵袭能力.结果 所构建的pPG-miR145-EGFP载体中插入基因片段与设计序列完全匹配;重组质粒转染SGC-7901细胞后,miR-145表达分别上调20.45倍(P＜0.01),细胞黏附能力分别下降51.5%(P＜0.01),细胞侵袭能力分别下降30.4%(P＜0.01).结论 成功构建人pre-miR-145真核表达载体,转染胃癌细胞过表达后,能抑制癌细胞的游走和侵袭能力.
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携带TPH-2基因小分子干扰RNA表达载体的构建与鉴定
目的 构建携带色氨酸羟化酶(TPH)-2基因的小分子干扰RNA表达载体.方法 设计并合成shRNA TPH-2对应的两条互补的寡核苷酸链,pU6-CMV-GFP质粒经Age Ⅰ和EcoRⅠ双酶切与退火后的寡核苷酸连接,目的 质粒转化感受态细胞,对长出的克隆应用菌落聚合酶链反应(PCR)鉴定,再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析.结果 经PCR、酶切及测序证实,pU6-CMV-GFP-TPH-2 shRNA表达载体片段大小为332 bp,其中插入的片段序列和位点与预期完全一致.结论 实验成功构建pU6-CMV-GFP-TPH2 shRNA表达载体.
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针对K-ras Asn12的短发夹RNA表达载体对胰腺癌细胞生长的抑制作用
我们利用RNAi技术达到了特异抑制胰腺癌突变K-rasAsn12的目的,现报道如下.一、材料和方法1.材料:AsPC-1和BxPC-3细胞株购自中科院上海细胞库.pSilenCircle试剂盒购自Allele公司.
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AKT2短发夹状RNA抑制胰腺癌细胞生长的研究
蛋白激酶B(PKB/AKT)是一种重要的信号蛋白分子,AKT蛋白与细胞生长代谢密切相关.AKT2是AKT蛋白3种主要亚型之一,有研究证实AKT2在胰腺癌中表达增高,且AKT2对胰腺肿瘤的发生发展有重要促进作用[1],本实验旨在研究AKT2短发夹状RNA表达载体对胰腺癌细胞生长的影响.
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胶质瘤单链抗体的基因构建及表达
单链抗体(ScFv)因其能较好地保持对抗原亲和活性,分子量小,穿透力强,抗原性弱,且易与效应分子相拼接,是构建免疫毒素和双功能抗体的较理想元件.我们在已克隆抗胶质瘤单抗SZ39重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因的基础上,构建了抗人脑胶质瘤ScFv基因,并克隆于表达载体pGEX-5X-1,在大肠杆菌中诱导表达,现将结果报道如下.
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雷帕霉素靶蛋白反义RNA真核表达载体的构建及其在血管平滑肌细胞中的表达
目的构建雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的反义RNA真核表达载体,观察其对血管平滑肌细胞(VSMC)功能的影响.方法提取人VSMC总RNA,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增mTOR基因cDNA序列,经pGEM-T载体克隆后双酶切,将cDNA序列反向插入绿色荧光蛋白表达载体pEGP-C1,转染VSMC,Western blot法检测反义表达载体对mTOR蛋白表达的影响,流式细胞仪检测细胞周期的变化.结果经RT-PCR获得664 bp产物,T载体克隆后,酶切确定该片段为mTOR基因cDNA,进而构建反义RNA真核表达载体pEGFP-C1-mTOR,测序证明序列正确后转染VSMC,证实其能够显著抑制mTOR蛋白产物表达,转染72 h的mTOR蛋白产物表达抑制率达82%,S期细胞由15%降低为7%,凋亡细胞增至9%.VSMC增殖过程在G1/G0期→S期受阻.结论成功构建mTOR基因的反义RNA真核表达载体.
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人乳头瘤病毒16型E7抗原表达模型的构建
目的:构建pEGFP-HPV16E7表达载体,并观察其在肝癌细胞中的瞬时和稳定表达及小鼠肝癌细胞皮下成瘤情况,为建立表达HPV16E7的实体瘤动物模型奠定基础.方法:应用基因重组技术,构建增强绿色荧光蛋白(EGFP)与HPV16E7的融合表达载体,经限制性内切酶酶切鉴定和PCR分析,用脂质体转染技术将其转入小鼠肝癌细胞,24 h 后RT-PCR检测HPV16E7 mRNA的生成,荧光显微镜观察EGFP-HPV16E7融合蛋白的表达,将转染细胞接种小鼠皮下,观察成瘤及成瘤后融合蛋白的表达情况.结果:酶切鉴定和PCR分析证实重组质粒中插入目的基因片段及载体DNA大小、方向和插入位点均正确,在转染的小鼠肝癌细胞中检测到HPV16E7 mRNA的生成和绿色荧光蛋白的表达,接种的转染细胞在小鼠皮下可成瘤且可检测到HPV16E7 mRNA的生成.结论:pEGFP-HPV16E7表达载体便于观察转染细胞中EGFP-HPV16E7融合蛋白的表达情况,小鼠肝癌细胞接种小鼠皮下可成瘤,成瘤后可检测到HPV16E7 mRNA的转录.
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VEGF165和VEGF165b真核表达质粒的构建和鉴定
目的:构建人血管内皮生长因子(VEGF)165和VEGF165b真核表达质粒,为VEGF165和VEGF165b功能研究奠定基础.方法:应用RT-PCR方法从人肺腺癌A549细胞中获得并扩增VEGF165 cDNA,双酶切后与真核表达载体pcDNA3.0连接,构建重组质粒pcDNA3.0-VEGF165,酶切、PCR及测序鉴定.以pcDNA3.0-VEGF165为模板,酶切重组的方法定点突变,获得VEGF165b cDNA全长,构建pcDNA3.0-VEGF165b,酶切、PCR和测序鉴定.将构建的VEGF165b真核表达质粒转染A549细胞,检测细胞内VEGF165b的表达变化.结果:酶切PCR和测序结果显示pcDNA3.0-VEGF165产物大小约690 bp,pcDNA3.0-VEGF165b为597 bp,两个重组质粒插入基因片段序列正确,无突变.VEGF165b转染A549细胞后,VEGF165b的表达增加.结论:成功构建了VEGF165和VEGF165b的真核表达质粒.
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核受体GCNF对H9C2心肌细胞的影响及作用机制
目的:研究人孤儿核受体生殖细胞核因子(hGCNF)对H9C2心肌细胞的影响并初探其机制.方法:通过感染Ad-hGCNF腺病毒使H9C2中的GCNF基因表达上调,利用间接免疫荧光化学技术确定其亚细胞定位,通过MTT法研究GCNF表达对细胞活力的影响,DAPI染色检测细胞凋亡水平,实时定量PCR及Western blot技术检测受体结合蛋白激酶2(RIPK2)和受体结合蛋白激酶3(RIPK3)的表达水平.结果:Ad-hGCNF腺病毒感染后,H9C2心肌细胞GCNF表达上调,亚细胞定位位于细胞核,细胞活力降低,凋亡水平显著增加,RIPK2和RIPK3表达水平均升高.结论:感染Ad-hGCNF腺病毒表达载体降低H9C2细胞活力,增加其凋亡水平,机制与RIPK2和RIPK3的表达上调有关.
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人β2-微球蛋白的可溶性表达和纯化鉴定
目的:制备高纯度人β2-微球蛋白(β2m),为其结构和功能研究奠定基础.方法:选用两种不同的表达载体pET15b和pET21b,表达人β2m;联合使用亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析、高压液相色谱等方法,纯化人β2m;采用SDS-PAGE和MALDI-TOF-MS质谱方法,鉴定人β2m.结果:使用改造过的N端组氨酸标签载体pET15b,在原核表达菌株E.coli2 BL21 (DE3)中,实现了人β2m稳定高效的可溶性表达;联合多种分离纯化方法,获得了色谱纯的人β2m,纯度达99％以上,质谱鉴定正确.结论:实现了人β2m的可溶性表达和制备,为进一步研究MHC Ⅰ类分子的结构和在免疫系统中的重要作用奠定基础.
关键词： 人β2-微球蛋白 表达载体 色谱 MALDI-TOF-MS -
LRIG1基因功能域载体的构建及亚细胞定位
目的构建含LRIG1胞外段+跨膜段(ET)及跨膜段+胞内段(TC)基因的真核表达载体, 并研究它们的亚细胞定位.方法以人LRIG1全长的质粒p3XFLAG-CMV-9-LRIG1为模板, PCR扩增出3XFLAG-LRIG1-ET和LRIG1-TC, 并将之分别亚克隆入真核表达载体pIRES2-EGFP-N1和p3XFLAG-CMV-9中. 酶切和DNA测序鉴定, 脂质体法将构建的质粒转染U251细胞, 观察标记基因荧光蛋白EGFP的表达, 间接免疫荧光检测标记基因3XFLAG的表达. 结果构建的质粒序列正确, 转染细胞后可检测到EGFP和3XFLAG基因的表达; LRIG1-ET和LRIG1-TC均主要表达在U251的胞膜上, 少量表达在胞浆. 结论包含LRIG1亚单位ET和TC的真核表达载体均构建成功, 其表达产物均主要位于胞膜, 少量位于胞浆.
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壳聚糖纳米粒作为基因治疗载体的研究进展
2003年底,首个基因治疗药物-重组人P53腺病毒注射液[1～3]在我国批准临床应用,标志着基因治疗进入了新时代.在基因治疗三要素:目的基因、表达载体、递送载体中,递送载体的构建和改进,一直是基因治疗研究的重点.
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转录抑制因子Bmi-1基因正、反义真核表达载体的构建
为研究转录抑制因子Bmi-1基因的功能及其作用机制,根据Bmi-1基因已知序列,设计合成一对引物,上下游引物分别加入XhoI和ClaI的酶切位点,用反转录PCR(RT-PCR)方法 从人红白血病细胞株(K562)总RNA中扩增编码Bmi-1的基因片段(1017bp),插入克隆载体pMD18-T,构建pMD18-Bmi1载体,经限制性核酸内切酶谱证实后,再克隆至逆转录病毒载体pLNCX2中,构建pLNCX2- Bmi1真核表达载体,并经测序证实.然后以pLNCX2- Bmi-1为模板,物扩增Bmi-1基因起始密码子及编码锌指结构区域上下171bp长度的核苷酸片段,并反向连接于表达载体(pLNCX2)上,得到反义Bmi-1真核表达载体并经测序证实,为进一步的基因转移和基因治疗研究奠定基础.
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人防御素-5基因原核表达载体pRSET-A的构建
目的 利用分子生物学技术和方法将pRSET-A质粒改建为带有人α-防御素5(HD-5α)基因的新型表达载体pRSET-HD-5α.为大量生产和提纯具有生物活性人防御素5抗菌肽的研究提供实验基础. 方法 PCR技术,以设计的引物P1/P2从cDNA文库中扩增人α-防御素5基因片段,并将扩增出来的目的基因和pRSET-A质粒用BamH Ⅰ和EcoRI双酶切后连接构成重组质粒,然后转化大肠杆菌DH-5α,筛选阳性克隆.后对PCR及酶切鉴定含有目的基因的克隆进行测序和电泳. 结果 获得α-防御素-5基因片断大小正确,经测序证明其碱基序列为编码目的基因的正确序列;电泳结果证明已将此片段克隆到pRSET-A内. 结论 成功构建了HD-5α基因的新型表达载体pRSET-A/HD-5α.
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胱抑素C基因真核表达载体的构建及在转染的人主动脉平滑肌细胞中的表达
目的 克隆人胱抑素C基因及构建胱抑素C基因真核表达载体并研究其在人血管平滑肌细胞中的表达.方法 培养人脐静脉内皮细胞系,并从中提取总RNA,采用逆转录聚合酶链反应扩增胱抑素C基因,构建其真核表达载体,双酶切及聚合酶链反应鉴定阳性克隆,转染人血管平滑肌细胞,逆转录聚合酶链反应及Western blot法检测其表达情况.结果 成功克隆人胱抑素C基因及构建其真核表达载体,转染后成功高表达.结论 克隆人胱抑素C基因及构建其真核表达载体成功,转染人血管平滑肌细胞获得其高表达.
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靶向载脂蛋白M基因小干扰RNA表达载体构建及其功能
目的 设计和构建载脂蛋白M基因特异性的小干扰RNA体内表达载体,筛选抑制载脂蛋白M表达的有效小干扰RNA,并初步探讨载脂蛋白M的功能. 方法以载脂蛋白M为目的基因,以产生小干扰RNA质粒载体pSilencerTM2.1-U6为表达模板,细胞内转录合成4条小干扰RNA,并构建携带荧光素酶报告基因的重组质粒载体plucF-载脂蛋白.将重组质粒载体plucF-载脂蛋白与产生小干扰RNA的质粒pSilencerTM2.1-U6共转染293T细胞,定量测量荧光素酶活性,初步筛选出抑制荧光素酶表达的有效小干扰RNA,然后将小干扰RNA转染L-02,逆转录聚合酶链反应检测载脂蛋白M mRNA的表达,进一步证实小干扰RNA对载脂蛋白M表达的抑制效果,酶联免疫吸附法检测有效小干扰RNA对载脂蛋白AⅠ、载脂蛋白B和载脂蛋白E合成和分泌的影响. 结果合成的4条小干扰RNA中有2条抑制荧光素酶表达,抑制效率分别为86%和91%,并特异性抑制肝细胞载脂蛋白M mRNA的表达;有效小干扰RNA能够有效抑制载脂蛋白AⅠ合成和分泌(P＜0.05),而载脂蛋白B和载脂蛋白E的含量无明显改变(P＞0.05). 结论成功构建并筛选到针对载脂蛋白M基因表达的有效小干扰RNA质粒,为研究冠心病的发病机制奠定基础.
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蛋白激酶B短发夹环RNA表达载体的构建及其对血管平滑肌细胞增殖活性的影响
目的 构建靶向蛋白激酶B基因的短发夹环RNA表达载体,观察其对血管平滑肌细胞增殖活性的影响.方法 设计多个针对大鼠蛋白激酶B基因的短发夹环RNA序列,化学合成方法合成并经pGEM-T载体克隆后双酶切,将cDNA序列插入逆转录病毒载体pLXIN,包装后获得蛋白激酶B的逆转录表达载体,感染血管平滑肌细胞,Northern blot和Western blot法检测蛋白激酶B及其下游底物的表达变化,流式细胞仪检测细胞周期变化,MTT法检测血管平滑肌细胞增殖活性的改变.结果 成功构建蛋白激酶B基因的逆转录病毒载体并包装,感染血管平滑肌细胞,证实其能显著抑制蛋白激酶B的mRNA和蛋白产物表达,下游的p70s6k表达相应减少;被感染血管平滑肌细胞的分裂、增殖过程受阻,更多细胞停滞在G0/G1期.结论 成功构建蛋白激酶B基因逆转录病毒RNA干扰表达载体,感染血管平滑肌细胞能够明显抑制其分裂、分化和增殖.
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HIF-1α特异性RNA干扰表达载体的构建及体外效应研究
目的 己知缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)在缺氧状态下可通过调节内皮素-1(ET-1)的升高而参与肺血管内皮细胞损伤及肺动脉高压,终导致肺出血.RNA干扰(RNAi)是双链RNA介导的序列特异性转录后同源靶基因沉默效应,目前RNAi技术已成为一种研究基因功能的有力工具,故拟通过构建人HIF-1α基因的特异性小干扰RNA(siRNA)真核表达载体,观测该载体在缺氧状态下对HIF-1α基因的干扰作用及对ET-1的抑制作用.方法 选择6个(a-f)可能的人HIF-1α siRNA干扰位点,设计合成相应的特异性互补寡聚核苷酸链(A～F),采用基因克隆技术,将合成的(A～F)链序列定向插入真核表达载体中,构建成重组质粒HIF-1α siRNA真核表达载体(A'～F'),通过脂质体法转染至体外人脐静脉内皮细胞(HUVECs)48 h,再以CoCl2(100μM)模拟缺氧刺激3 h后,观测siRNA对HIF-1αmRNA和HIF-1α蛋白表达的抑制效应及ET-1水平.结果 ①成功构建了分别针对6个HIF-1αsiRNA干扰位点(a～f)的重组质粒HIF-1α siRNA真核表达载体(A'-F');②该6组真核表达载体转染HUVECs并经CoCl2模拟缺氧刺激后,与未转染组比较,结果 显示B'及D'组明显抑制HIF-1α mRNA及HIF-1α蛋白的表达,并部分抑制ET-1表达,而其余4组与未转染组比较并无差异.结论 针对b及d干扰位点的B'及D'特异性siRNA真核表达载体,能明显干扰HIF-1α基因的表达,进而抑制ET-1的释放.该实验为下一步用B'、D'特异性siRNA真核表达载体在动物体内研究HIF-1α与新生儿缺氧性肺出血关系奠定基础.
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重组人RNA聚合酶Ⅱ转录调节物12-Fc融合蛋白载体的构建和表达
目的 用pIRES2-EGFP-Fc载体构建重组人RNA聚合酶Ⅱ转录调节物12(MED12)-Fc真核表达质粒,转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞表达MED12-Fc融合蛋白,纯化和鉴定MED12-Fc.方法 根据GenBank中的序列信息,从基因组上扩增出人MED12基因第2、3和4外显子,并通过Overlap聚合酶链反应(PCR)拼接获得目的基因片段,以pIRES2-EGFP-Fc真核表达质粒为载体,构建重组人MED12-Fc真核表达质粒.使用脂质体瞬时转染293T细胞,48 h收集上清液,用酶联免疫吸附法(ELISA)鉴定质粒的表达能力.表达质粒电转CHO细胞,通过G418抗性筛选及流式细胞仪荧光筛选,获得高表达的稳定细胞株.使用稳定细胞株培养表达人MED12-Fc融合蛋白,收集上清液,用Proein A亲和纯化柱纯化蛋白.十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)检测蛋白质分子量.结果 通过DNA测序和瞬时转染表达鉴定,证实MED12第2、3和4外显子基因序列正确,成功获得重组人MED12-Fc真核表达质粒.通过电转化、G418及流式细胞仪荧光筛选,获得高表达重组人MED12-Fc的稳定表达细胞株.通过细胞培养,亲和层析纯化,获得高纯度的重组人MED12-Fc融合蛋白.结论 成功构建MED12-Fc融合蛋白的表达载体,获得高纯度的重组人MED12-Fc融合蛋白,为进一步研究MED12蛋白功能奠定基础.
关键词： RNA聚合酶Ⅱ转录调节物12 融合蛋白 表达载体 -
pGAPZαA/HD5酵母表达载体的构建
目的 利用分子生物学技术和方法将pGAPZαA质粒改建为带有人防御素5(HD5)基因的新型表达载体pGAPZαA/HD5,为大量生产和提纯具有生物活性人防御素5抗菌肽的研究提供实验基础.方法 PCR技术,以设计的引物P1/P2从克隆载体pMD18-T/HD5中扩增人防御素5基因片段,并将扩增出来的目的 基因和pGAPZαA质粒用EcoRI和XbaI双酶切后连接构成重组质粒,然后转化至E.coli Top10感受态细胞,筛选阳性克隆.后对PCR及酶切鉴定含有目的 基因的克隆进行测序和电泳.结果 获得HD5基因片断大小正确,经测序证明其碱基序列为编码目的 基因的正确序列;电泳结果证明已将此片段克隆到pGAPZαA内.结论 成功构建了HD5基因的新型表达载体pGAPZαA/HD5.
