双功能抗体药物研究进展

抗体类药物近20年来蓬勃发展，目前全球上市的抗体药物已经有40多个品种，其治疗领域也从传统的癌症、自身免疫性疾病逐步扩展到抗感染和代谢性疾病等。2013年全球10大畅销药物中有6个是抗体类药物，包括3个自身免疫病治疗性药物和3个抗肿瘤抗体。单克隆抗体发展的同时也开启了对新结构、新功能抗体药物的探索，以期进一步优化抗体药物功能活性。抗体糖基化改造（afucosylation）、抗体-药物偶联（antibody drug conjugate， ADC）、双功能抗体（bispecific antibodies，BsAb）等都是当前抗体药物研发的热点领域。单克隆抗体能够特异性结合靶抗原上特定的表位，其优势在于亲和力高、专一性强。但传统抗体仅结合单一靶点的单一表位，因此其疗效受到一定限制。药理学研究揭示，多数复杂疾病都涉及多种与疾病相关的信号通路，例如肿瘤坏死因子 TNF、白介素6等多种促炎症细胞因子同时介导免疫炎性疾病，而肿瘤细胞的增殖往往是由多个生长因子受体的异常上调造成的。单一信号通路的阻断通常疗效有限，而且容易形成耐药性。因此，开发能够同时结合两个不同靶点的双功能抗体及其类似物，长期以来成为新结构抗体研发的重要领域。早期在免疫原性、结构稳定性以及抗体质量控制等方面的不足，限制了双功能抗体的进一步的发展。近年来，上游基因工程抗体和下游生产工艺技术的改进，克服了传统双功能抗体的缺陷，从而推动了多类新型双功能抗体进入临床开发阶段。目前主要在研的双功能抗体从作用机制上可分为双重信号阻断型和抗CD3+T 细胞介导的双功能抗体；从结构上可分为由单链抗体或 Fab 区组成的小型抗体和全抗体；从生产工艺上可分为原核或真核表达、单细胞内表达和双细胞系表达结合体外装配等方式。本文就双功能抗体的新进展进行简要综述。

双功能抗体介导胃癌杀伤效应的研究

目的以化学方法将抗CD3及抗三硝基苯(TNP)的单克隆抗体(McAb)交联为双功能抗体.利用此双功能抗体介导人外周血淋巴细胞(PBLS)对于不同抗胃癌McAb所针对的胃癌细胞进行体内外杀伤试验.方法利用化学交联法制备双功能抗体,以酶联免疫吸附试验(ELISA)测定McAbs 活性,以ELISA桥联法、琼脂糖免疫双扩散及十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对于双功能抗体进行鉴定,以细胞杀伤试验及肿瘤生长抑制试验检测双功能抗体作用.结果将抗CD3及抗TNP McAb交联为双功能抗体,此双功能抗体可介导PBLS对于不同抗胃癌McAb所针对的胃癌细胞进行体内外杀伤试验.结论此双功能抗体在肿瘤生物免疫治疗中具有应用前景.

抗HBS-碱性磷酸酶双功能抗体的分析及试用

双特异性抗体药物的研究进展

双特异性抗体是一类具有双功能的抗体分子,可以同时特异性结合2个不同的抗原.由于其特异性和双功能性,现已成为抗体工程领域的研究热点,在肿瘤免疫治疗及自身免疫病等领域中具有广阔的应用前景.目前,至少有30多种双特异性抗体药物处于临床研究阶段.本文主要对双特异性抗体药物的开发历史、分子结构和设计策略、作用机制等进行简要综述.

单克隆抗体类生物治疗药物研究进展

目的 综述2013年国内外抗体药物的研究进展,为我国抗体药物研发和产业化提供参考.方法 根据近年来国内外相关文献报道,对我国抗体药物在2013年的进展,从国内外现状、抗体生物类似药和质量控制三方面进行归纳总结.结果与结论 抗体药物以其高特异性、高效性和半衰期长等特点具有独特的优势,创造出巨大的社会效益和经济效益.我国针对生物医药产业的瓶颈,紧紧抓住抗体药物研发的大趋势,快速推进抗体技术的进步并建立和完善相应的技术平台,逐步实现了研发产品的产业化与国际化.本文详细介绍了国内外抗体药物及其生物类似药研发现状,以及我国抗体药物质量控制方面的研究进展,为国内抗体药物的研发和质量评价提供参考.

阿糖胞苷对抗CD3/抗P-gp双功能抗体介导的T淋巴细胞免疫杀伤多药耐药白血病细胞的影响

目的 探讨阿糖胞苷对抗CD3/抗P-gP双功能抗体介导的T淋巴细胞免疫杀伤多药耐药白血病细胞的影响.方法 采用抗E-tag亲和层析柱分离纯化抗CD3/抗P-gp微型双功能抗体,用阿糖胞苷刺激K562和K562/A02细胞,并用流式细胞术检测K562和K562/A02细胞B7-1、B7-2分子的表达,用CytoTox 96非放射性细胞毒试剂盒检测阿精胞苷对抗CD3/抗P-gp双功能抗体介导的T淋巴细胞免疫杀伤K562/A02细胞的影响.结果 经阿糖胞苷刺激的K562和K562/A02细胞B7-1、B7-2分子的表达较未刺激的对照组明显升高.阿糖胞苷对抗CD3/抗P-gp双功能抗体介导的T淋巴细胞在效靶比0.39:1～25:1范围内,激活T细胞对耐药白血病细胞的杀伤率为(16.44±1.20)%～(60.49 ± 2.90)%,其杀伤率与效靶比和抗体浓度呈依赖关系(P＜0.05).结论 阿糖胞苷可明显提高抗CD3/抗P-gp双功能抗体介导的人T淋巴细胞对高表达P-gp抗原的耐药白血病细胞的杀伤效应.

双功能抗体介导结肠癌细胞杀伤效应的研究

目的:研究抗CD3/抗TNP双功能抗体与TNP化抗癌胚抗原(CEA)McAb结合,在裸鼠体内对结肠癌细胞的杀伤作用.方法:将抗癌胚抗原单抗TNP化,TNP化后的抗CEA单抗(TNP-CEA)、抗CD3/抗TNP双功能抗体、人淋巴细胞及结肠癌细胞CL187接种于裸鼠体内,计算肿瘤生长体积,观察成瘤率.结果:双功能抗体能够介导PBLs对CL187细胞的杀伤作用.结肠癌细胞CL187的成瘤能力受到抑制,成瘤率为0/4.结论:此双功能抗体在免疫治疗中具有潜在的应用价值.

抗人膀胱癌/抗VEGF双功能基因抗体导入治疗荷瘤鼠膀胱癌的研究

目的:探讨抗人膀胱癌/抗VEGF双功能基因抗体对膀胱癌生长的抑制作用.方法:应用双功能抗体作用荷瘤鼠模型,观察抑瘤作用;应用免疫组化技术检测体内生长肿瘤中微血管密度.结果:双功能抗体对体内生长的肿瘤有明显的抑制作用,经双功能抗体治疗的瘤体中微血管密度明显低于对照组.结论:双功能抗体可以抑制肿瘤血管生成,有望为膀胱癌的治疗提供新的方法.

抗皂角毒、表皮生长因子受体双功能抗体的制备与体外效应的研究

目的:研究制备抗皂角毒和表皮生长因子受体双功能抗体,用以导向皂角毒杀伤肿瘤细胞.方法:在制备EQ75、CY12.14单克隆抗体细胞株的基础上,通过杂交-杂交瘤技术制备双功能抗体细胞株.结果:双功能抗体(EQ75×CY12.14)与单用皂角毒杀伤肿瘤细胞(A431)的IC50分别为10-9.6、10-8.4 mol/L.结论:双功能抗体(EQ75×CY12.14)杀伤肿瘤细胞(A431),以IC50值计算,有效率为单用皂角毒的15倍左右.

抗人膀胱癌/抗VEGF双功能基因抗体制备及体外效应研究

目的:研究制备抗人膀胱癌和抗血管内皮生长因子的双功能抗体,用以导向抑制肿瘤新生血管的形成.方法:在制备抗人膀胱癌和抗血管内皮细胞生长因子单克隆抗体的基础上制备双功能抗体.结果:双功能抗体的IC50为10-9.5,抗血管内皮生长因子抗体的IC50为10-8.9,抗人膀胱移行细胞癌单克隆抗体的IC50为10-8.3.结论:双功能抗体的有效率明显高于单克隆抗体.

抗人喉癌/抗CD3双功能抗体的制备及对Hep-2细胞株的杀伤作用

目的:研究制备抗人喉癌/抗CD3双功能抗体,探讨喉癌主动免疫治疗.方法:以化学方法将人喉癌及抗CD3单克隆抗体交联为双功能抗体,进行介导对肿瘤细胞的杀伤作用.结果:该双功能抗体介导效应细胞对靶细胞的杀伤率高于抗CD3的介导作用,并随着效靶比的提高而升高.结论:采用化学交联法制备的抗人喉癌/CD3双功能抗体具有潜在的临床应用价值.

抗人膀胱癌/抗VEGF双功能基因抗体的动物实验研究

目的探讨抗人膀胱癌/抗VEGF双功能基因抗体对人膀胱癌生长及淋巴转移的影响.方法通过构建人膀胱癌裸鼠皮下移植瘤模型并注射双功能抗体,观察肿瘤生长及盆腔淋巴结转移情况,同时采用免疫组化法检测肿瘤微血管密度值及凋亡的肿瘤细胞指数.结果肿瘤大小:实验组为(19.50±4.51),对照组为(57.62±8.31),两组比较差异有极显著性意义(P<0.01);肿瘤微血管密度:实验组为(2 351±207),对照组为(4 356±548),两组相比差异具有显著性意义(P<0.05);凋亡指数:实验组为19.25,对照组为9.31,两者比较,差异有统计学意义(P<0.05);盆腔转移:实验组无一只发生,而对照组为75.0%,两组比较,差异有极显著性意义(P＜0.01).结论抗人膀胱癌/抗VEGF双功能基因抗体对人膀胱癌具有良好的靶向性,能够通过抑制肿瘤微血管形成和加速肿瘤细胞凋亡,遏制实验性人膀胱癌的生长转移,为该抗体用于临床膀胱癌的治疗提供了一定的实验依据.

抗人膀胱癌/抗CD3双功能基因抗体对LAK细胞增殖和细胞毒作用的体外研究

目的探讨抗人膀胱癌/抗CD3双功能基因抗体对LAK细胞增殖和增强细胞毒的作用.方法采用125I-UdR释放试验等检测方法.结果双功能抗体显著提高LAK细胞与肿瘤细胞结合率,促进淋巴细胞增殖,加入双功能抗体后,LAK细胞对肿瘤细胞细胞毒性明显增加.结论抗人膀胱癌/抗CD3双功能基因抗体可以大大促进LAK细胞增殖和增加细胞毒性作用,为膀胱癌的治疗提供新的方法.

抗人膀胱癌双功能抗体的制备与鉴定

目的:制备抗人膀胱癌双功能抗体(BfAb)并进行体外实验与鉴定.方法:提取膀胱癌抗原,应用膀胱癌抗原通过杂交瘤技术制备抗人膀胱癌单克隆抗体,后者经胃蛋白酶水解后制备抗人膀胱癌单克隆抗体的F(ab′)2片段.然后将该片段通过二次杂交制备杂交瘤,用其免疫新西兰白兔,血清经凝胶纯化后获抗人膀胱癌BfAb,应用ELISA和免疫组化方法进行鉴别.结果:抗人膀胱癌BfAb与抗人膀胱癌单克隆抗体呈阳性反应,与BALB/C小鼠γ球蛋白呈阴性反应;BfAb可以同时结合靶细胞的肿瘤抗原和效应细胞表面的触发分子,引发正常细胞对肿瘤细胞的防御机制.结论:BfAb既能竞争性地与膀胱移行细胞癌抗原结合,又具有激活淋巴细胞的功能,从而特异性的直接杀伤癌细胞并诱发一系列的免疫应答反应.

抗人膀胱癌双功能抗体的临床应用

目的:研究抗人膀胱癌双功能抗体的主动免疫治疗作用,为临床应用提供理论依据.方法:用抗人膀胱癌双功能抗体主动免疫治疗膀胱癌病人,同时用生理盐水注射作为对照组,检测血清中人抗鼠抗体的产生情况、治疗前后各项体液免疫指标及NK细胞活性变化.结果:与对照组相比,治疗组病人的免疫指标上升.结论:抗人膀胱癌双功能抗体有增强免疫力的作用,可能是膀胱癌治疗的一种有益的辅助疗法.

抗CD3/抗CD19微型双功能抗体的构建、表达及活性测定

背景与目的:微型双功能抗体是基因工程抗体的-种形式,它具有两个抗原结合位点,可选择性募集效应细胞到靶细胞周围,介导特异性杀伤作用.本实验构建抗CD3/抗CD19微型双功能抗体(diabody)载体,表达纯化后测定其生物学活性.方法:用重叠PCR(overlap PCR)和PCR方法,构建抗CD3/抗CD19 diabody 载体,转化感受态大肠埃希菌进行原核表达.表达产物经抗His-tag亲和层析柱分离纯化,12%SDS-PAGE电泳及Western blot鉴定.应用间接免疫荧光和竞争性免疫荧光结合流式细胞分析技术(PACS)检测生物学活性.结果:基因重组质粒经测序证实序列正确.抗CD3/抗CD19 diabody能够在原核表达系统中进行可溶性表达.12%SDS-PAGE显示28×103和26×103各有-条带,Western blot在28×103显示有条带,与预期相符.表达产物经纯化定量可达5 mg/L.FACS检测抗CD3/抗CD19 diabody可与CD19+ Raji细胞和CD3+ Jurkat细胞特异结合,并能竞争性抑制HIT3a和HIT19a与上述细胞的结合活性.结论:本实验成功构建了抗CD3/抗CD19 diabody,并且能够进行可溶性表达,可与CD19+ Raji细胞和CD3+ Jurkat细胞特异结合,为以后的抗体功能实验奠定了基础.

抗人EGFR/抗CD3双功能抗体治疗胰腺癌的实验研究

目的 初步验证化学偶联法合成的EGFR/CD3双功能抗体在体外对胰腺癌细胞的杀伤作用.方法 在前期化学偶联法合成EGFR/CD3双功能抗体的基础上,进行效应细胞及靶细胞结合率检测及51Cr杀伤实验检测,探讨其影响效应细胞与胰腺癌细胞结合及杀伤能力的作用,并与EGFR单抗比较.采用流式细胞仪检测处理后肿瘤细胞周期与凋亡情况变化.结果 EGFR/CD3双功能抗体与效应细胞(PBLS细胞)及胰腺癌细胞株SW1990结合率较高,可满足治疗需求;EGFR/CD3双功能抗体联合效应细胞对胰腺癌细胞株SW1990杀伤率显著高于各对照组(P＜0.05).EGFR/CD3双功能抗体联合效应细胞处理后肿瘤细胞凋亡率上升.结论 EGFR/CD3双功能抗体可有效增强免疫效应细胞对胰腺癌的杀伤作用,具有潜在的临床应用价值.

抗人EGFR/抗CD3双功能抗体的制备、检测及对胃癌细胞毒性作用的实验研究

目的 探讨抗EGFR/抗CD3双功能抗体体外对胃癌细胞的杀伤能力,为临床应用该抗体治疗胃癌打下实验基础.方法 采取化学偶联法合成抗EGFR/抗CD3双功能抗体并使用间接细胞免疫荧光法检测该抗体的功能.通过细胞结合率检测及MTT杀伤实验检测其对胃癌细胞结合及杀伤的能力并与单纯的EGFR单抗和CD3单抗比较.结果 抗EGFR/抗CD3双功能抗体联合效应细胞与胃癌细胞株SGC7901结合率显著高于两组单抗对照组(P＜0.05)；MTT细胞杀伤实验结果提示:抗EGFR/抗CD3双功能抗体组对胃癌细胞株SGC7901杀伤率显著高两组单抗对照组(P＜0.05).结论 初步的体外实验显示由化学偶联法合成的抗EG-FR/抗CD3双功能抗体可能对胃癌有一定的治疗作用,具有进一步研究的价值.

抗人膀胱癌/抗VEGF双功能基因抗体对膀胱癌生物学行为的影响

目的:探讨抗人膀胱癌/抗VEGF双功能基因抗体对人膀胱癌生长及转移的影响.方法:通过构建人膀胱癌裸鼠皮下移植瘤模型并注射双功能抗体,观察肿瘤生长及盆腔淋巴结转移情况,同时采用免疫组化法检测肿瘤微血管密度值及凋亡的肿瘤细胞指数.结果:肿瘤大小:双抗组为(19.50±4.51)mm2,对照组为(57.62±8.31)mm2,两组比较P<0.01;肿瘤微血管密度双抗组为(2 351±207)个,对照组(4 356±548)个,两组相比P<0.05;凋亡指数双抗组为19.25,对照组为9.31,两者比较P<0.05;双抗组无一只发生盆腔转移,而对照组为75.0%,两组比较P<0.05.以上各项组间差异均有统计学意义.结论:抗人膀胱癌/抗VEGF双功能基因抗体对人膀胱癌具有良好的靶向性,能够通过抑制肿瘤微血管形成和加速肿瘤细胞凋亡,遏制实验性人膀胱癌的生长转移,为该抗体用于临床膀胱癌的治疗提供了一定的实验基础.

胶质瘤单链抗体的基因构建及表达

单链抗体(ScFv)因其能较好地保持对抗原亲和活性,分子量小,穿透力强,抗原性弱,且易与效应分子相拼接,是构建免疫毒素和双功能抗体的较理想元件.我们在已克隆抗胶质瘤单抗SZ39重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因的基础上,构建了抗人脑胶质瘤ScFv基因,并克隆于表达载体pGEX-5X-1,在大肠杆菌中诱导表达,现将结果报道如下.