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抗卵巢癌单链免疫毒素183B2ScFvPE38融合蛋白的高效表达及活性测定
目的制备抗人卵巢癌单链免疫毒素融合蛋白183B2ScFvPE38,并对其活性进行测定,为卵巢癌导向治疗打下基础. 方法在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)的诱导下,高效表达免疫毒素183B2ScFvPE38,并采用直接ELISA及细胞毒性实验对抗体及毒素部分的活性进行检查 . 结果表达蛋白183B2ScFvPE38以包涵体形式为主高效表达,并有少量可溶性表达.该蛋白具有较好的抗体活性及毒素活性. 结论抗卵巢癌单链免疫毒素183B2ScFvPE38具有良好的免疫学活性及生物学活性,有良好的应用前景.
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抗隐孢子虫子孢子ScFv-PE40免疫毒素表达质粒的构建及其在大肠杆菌中的表达
用PCR方法扩增抗隐孢子虫子孢子ScFv片段,插入表达载体pET-28a中,构建重组质粒pET-28-ScFv,然后,将绿脓杆菌外毒素(PE40)片段定向克隆到ScFv基因的下游,构建免疫毒素表达质粒pET28ScFv-PE40.经酶切分析、PCR检测和测序进行鉴定.成功地构建了免疫毒素表达质粒pET28 ScFv-PE40.将上述质粒转化受体菌BL21(DE3)后,经IPTG诱导,成功地表达了目的蛋白.免疫毒素ScFv-PE40大小约为66kDa,表达量约占菌体蛋白总量的14%.
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急性淋巴细胞白血病新治疗策略(中)
3 单克隆抗体 白血病细胞表达的家系相关性抗原正日益成为单克隆抗体治疗的靶点,单克隆抗体可以非结合方式用药,也可与抗白血病药物、免疫毒素或放射性分子结合后用药.抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞的相关研究不断发展,从而大大拓展了家系相关性抗原在细胞免疫治疗中的重要性.单克隆抗体己被成功地单独及联合使用(表1).但靶抗原并不单纯由白血病幼稚细胞表达,也可由正常造血细胞表达,从而降低了单克隆抗体细胞毒性的选择性.
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去T细胞脐血低温保存的研究
目前的研究表明,非血缘关系的脐血移植(umbilical cord blood transplantation, CBT) 也是重要的造血干细胞来源[1].而脐血库的建立为开展配型不合的CBT提供了保证.但是,CBT可能发生移植物抗宿主病(graft versus host disease, GVHD),尤其是配型不合的CBT,从而影响移植成功率.免疫毒素(immunotoxin,IT)能有效去除脐血T细胞而对造血祖细胞无明显影响[2],为预防重度GVHD提供了有效手段.我们观察了IT去除脐血T细胞后的冻存效果.报告如下.
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VEGF165-PE38重组免疫毒素真核表达载体的构建及表达
目的 构建血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因和铜绿假单胞菌外毒素衍生物(PE38)基因的真核融合表达载体,研究其在HEK293细胞中的表达情况.方法 通过PCR获得实验需要的VEGF165基因片段,通过酶切pRB391质粒获得铜绿假单胞菌外毒素衍生物PE38基因,再通过适当的酶切及连接反应,构建VEGF165与PE38融合基因的真核表达载体pIRES2-VEGF165-PE38-EGFP,重组质粒经限制性内切酶及DNA序列测定证实构建成功后,用Lipofectamine2000脂质体转染HEK293细胞,然后用RT-PCR及ELISA法检测VEGF165-PE38融合蛋门在HEK293细胞的表达.结果 酶切分析及DNA序列测定证实,VEGF165-PE38融合基因被成功克隆入真核表达质粒载体pIRES2-EGFP,RT-PCR及ELISA法检测证实重组基因可在HEK293细胞表达.结论 VEGF165-PE38融合基因可在HEK293细胞中表达,为进一步研究其对肿瘤血管内皮细胞的靶向毒性及临床应用奠定基础.
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人源化免疫毒素的研究进展
免疫毒素是通过化学连接或基因融合的方法将细胞选择性配体与毒素分子相连组成的嵌合体蛋白,它能够靶向肿瘤细胞高表达的肿瘤相关抗原、膜受体和糖蛋白.尽管以细菌毒素或植物毒素为基础的免疫毒素显示出良好的应用前景,但细菌毒素和植物毒素的免疫原性和非特异的细胞毒性等因素,阻碍了它们在临床上的应用.针对这些问题,以人源蛋白如促凋亡蛋白与RNA酶为毒素部分的新一代免疫毒素被研发出来,本文对此类人源化免疫毒素的体内外实验研究进展进行综述.
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针对HER2靶点的抗体药物研究与肿瘤靶向治疗
人类表皮生长因子受体2(HER2)属于跨膜酪氨酸激酶受体家族的成员,在肿瘤细胞中存在过表达.研究显示在乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肺癌、前列腺癌中均存在不同程度的HER2过表达.抗体靶向治疗与传统化疗相比,特异性强,毒副作用小.本文介绍了曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的单药治疗效果和与化疗药物、激素治疗、疫苗的联合治疗效果,以及偶联药物策略,阐述了其他新型抗HER2抗体药物,特别是双特异抗体、免疫毒素以及抗体融合蛋白等研究近况,为相应的HER2抗体药物开发和临床应用提供参考.
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抗体药物偶联物及其在恶性血液系统肿瘤治疗中的应用
单克隆抗体靶向治疗是目前临床肿瘤治疗的热点.针对抗体分子大而组织穿透性差以及临床使用剂量大、生产成本高的问题,抗体的小型化和高效性设计已成为抗体药物研发的新趋势.近年来,单抗与细胞毒性药物的结合物被称为抗体药物偶联物(antibody-drug conjugates,ADCs),已加入到抗癌药物的行列中,成为新型的抗体药物而受到广泛关注.泛义的ADC通常由抗体、接头(linker)和效应分子等3部分组成.根据效应分子的不同,可将ADC分为化学免疫偶联物、免疫毒素、放射性免疫偶联物等3类.ADC被内化进入细胞后,通过细胞内的化学和酶解作用释放出细胞毒性物质,细胞毒性物质则通过抑制蛋白合成、解聚微管蛋白或断裂双链DNA等作用而对靶细胞产生杀伤作用.近年来,FDA已经批准2种ADC药物上市,有多种处于Ⅱ～Ⅲ期临床试验阶段,取得了显著的临床效果,吸引了越来越多的制药企业争相竞逐.本文介绍ADC的过去和现状,结合临床肿瘤应用中的实际问题,探讨其将来的发展趋势.
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相思子毒素的分子特点及其在临床中的应用前景
相思子毒素是从豆科植物(Abrus Precatorius L.)种子中分离的一种细胞毒性蛋白.它由A,B两条链组成,由一个二硫键相连,B链具有半乳糖凝集活性,可与细胞膜上受体结合,帮助A链进入细胞内,A链进入细胞催化60S大亚基的28S rRNA的第4324位脱去腺嘌呤而使60S核糖体亚基失活,从而使细胞蛋白合成被抑制.本文综述了有关相思子毒素的分子结构特点、毒性机制和在临床中的应用前景.
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抗膀胱癌免疫毒素腔内灌注预防膀胱癌术后复发的临床观察
目的探讨免疫毒素(IT)灌注预防膀胱癌术后复发的疗效及副作用.方法本项研究采用免疫组化方法对膀胱癌标本进行免疫毒素结合活性研究,分析了结合活性与分级、分期的关系.并用免疫毒素灌注膀胱30例,预防膀胱癌复发,结合以前灌注免疫毒素、卡介苗、丝裂霉素-C的随访资料结果进行综合分析.结果免疫毒素的结合活性,G1与G3间有显著性差异,随分级的增高而增强(P<0.05),G1与G2、G2与G3间无显著性差异,但随分级增高有增强趋势,结合活性与分期无明显关系(P>0.05).在膀胱灌注预防膀胱癌复发的3组中,1年内、2年内复发率相似无明显差异(P>0.05).IT组副作用明显低于BCG组和MMC组(P<0.01),而BCG组和MMC组间副作用无明显差异(P>0.05).结论免疫毒素的结合活性G1与G3级肿瘤间有显著性差异,呈正相关,而与分期无关,这提示免疫毒素可能对恶性程度高的肿瘤预防效果好.免疫毒素的近期疗效与BCG和MMC相似,副作用明显小于后两者.
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全身免疫毒素治疗抑制裸鼠发生人乳腺癌转移和癌生长
据
2000年88卷第6期报道乳腺癌病人的辅助化疗只取得了有限的成功,这大概是同时出现耐药细胞克隆而使非扩散细胞失去作用的缘故.自从了解到免疫毒素可使扩散依赖性细胞毒受到影响后,挪威奥斯陆市挪威人镭医院癌症研究所0.Enge-braaten等研究人员,对模拟微转移疾病的裸鼠模型进行了全身抗肿瘤免疫毒素作用的研究. -
免疫毒素构建的研究进展
免疫毒素(Immunotoxins,Its)作为肿瘤靶向治疗的策略之一,是将具有导向能力的载体与具有细胞毒性的分子组合而成的具有特异性杀伤能力的杂合分子,被称为"生物导弹"[1].因此,在构建免疫毒素时,既要寻找具有细胞选择性的定向"载体",又要筛选高效的毒素"弹头".目前研究认为,免疫毒素杀伤肿瘤细胞主要通过以下两种方式[2]:一是通过与细胞表面受体结合,进入胞内抑制蛋白质合成而发挥作用;二是毒素蛋白直接作用于细胞膜,使得细胞内容物泄漏,终致细胞死亡.本文主要从作用靶点的选择,弹头与载体的设计以及两者的连接方法等几个方面综述免疫毒素构建的研究进展.
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rRTA:DS27免疫毒素的制备及胞内运输研究
目的:探讨免疫毒素rRTA:DS27的内化行为.方法:用原核系统来获得重组蓖麻毒素A链(rRTA);用胶体金双标记法进行Molt4细胞中免疫毒素的导向研究.结果:CM-Sephorose一步纯化到电泳纯的rRTA,电镜观察到rRTA:DS27遵循特异的胞内运输途径.结论:上述结果对于深入了解免疫毒素的作用机理,并进而改善其临床应用具有重要作用.
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新型肝癌免疫毒素A54-PE40KDEL的构建表达与活性鉴定
目的:构建新型肝癌免疫毒素A54-PE40KDEL的原核表达载体,诱导表达后检测其生物活性.方法:PCR扩增绿脓杆菌外毒素A PE40KDEL基因插入到pET32a(+),然后与合成的含有肠激酶酶切位点和肝癌特异性结合肽A54的核酸序列连接,构建重组表达载体pET32a(+)-A54-PE40KDEL,其经鉴定后转化E.coli BL21 表达.超声破菌,上清液经Ni+亲和层析纯化,肠激酶酶切,再次Ni+离子亲和层析后得到免疫毒素A54-PE40KDEL.MTT和间接免疫荧光技术检测其对不同细胞株的细胞毒性及靶向性.结果:重组质粒序列正确,经Western blot证实表达产物含Mr约58 000的目的蛋白.A54-PE40KDEL能够与肝癌细胞特异性结合,且对肝癌细胞的毒性作用与对照相比有极显著性差异(P＜0.01).结论:成功构建了A54-PE40KDEL原核表达载体;获得的新型肝癌免疫毒素A54-PE40KDEL在体外与肝癌细胞具有一定结合特异性及杀伤活性,为肝癌导向治疗提供了一条可行的途径.
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靶向EGFR免疫毒素BI7D12-PE38KDEL的制备及其体外活性测定
目的:构建基于EGFR纳米抗体的免疫毒素BI7D12-PE38KDEL,并检测其对EGFR肿瘤细胞的细胞毒作用.方法:采用分子克隆技术,将靶向EGFR的纳米抗体7D12以二价的形式,通过柔性连接肽(G4S)4与铜绿假单胞菌外毒素的截断形式PE38KDEL连接,构建原核表达载体pET28a-BI7D12-PE38KDEL.然后将其转化到BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG进行诱导表达.通过镍柱亲和层析法纯化目的蛋白,并经Western blot验证.通过流式细胞技术检测该免疫毒素与EGFR阳性细胞A549、HT29、MCF-7和EGFR阴性细胞CEM、Jurkat的结合能力后,将其按照一定的浓度梯度进行细胞毒实验研究,72 h后,使用WST-1试剂检测BI7D12-PE38KDEL对上述细胞的杀伤效果.结果:通过SDS-PAGE和Western blot实验验证,成功的制备了重组免疫毒素BI7D12-PE38KDEL,该毒素大部分以可溶性的方式表达.BI7D12-PE38KDEL能够与EGFR阳性的A549、HT29、MCF-7肿瘤细胞特异性的结合,并且对上述细胞的细胞毒作用与阴性对照组CEM和Jurkat相比具有极其显著性差异(P<0.01).结论:成功地构建了基于EGFR纳米抗体的重组免疫毒素BI7D12-PE38KDEL,该免疫毒素能特异性的结合并杀伤EGFR阳性的肿瘤细胞.
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蜂毒肽/变构hIL-2融合蛋白的原核表达及其对宿主菌生长的影响
目的 构建蜂毒肽(Melittin)与变构hIL-2融合基因原核表达质粒,并检测表达的融合蛋白对宿主菌E. coli生长的影响.方法 以质粒pGEX-4T-2/Melittin-IL-2(88Arg)为模板,通过PCR定点诱变为Melittin-IL-2(88Arg,125Ala).将PCR产物和pET-15b载体分别经双酶切后连接,构建重组表达质粒pET-15b/M-IL-2(88Arg,125SAla),转化E. coli BL21(DE3),IPTG诱导表达.SDS-PAGE及ELISA分析表达产物;检测诱导不同时间重组菌的A600值,绘制生长曲线,并进行活菌计数.结果 PCR扩增的目的 片段长542 bp,重组表达质粒测序分析证明目的 基因如预期突变;ELISA可检测到目的 蛋白表达,但表达量较低;SDS-PAGE分析未见目的条带;诱导表达4 h,重组菌A600值由0.8 下降至0.6;诱导2 h,活菌计数由108个/ml降至104个/ml.结论 已成功构建了原核表达质粒pET-15b/M-IL-2(88Arg,125Ala),表达的融合蛋白可能对宿主菌具有毒性,从而杀伤宿主菌.
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重组DT/bFGF融合蛋白基因表达载体的构建及表达产物的纯化
目的构建重组DT/bFGF融合蛋白表达载体,制备高纯度的DLF融合毒素.方法PCR扩增DT389和bFGF的编码DNA序列,经酶切和连接,克隆至表达载体pET-30a,转化E.coli BL21(DE3),鉴定阳性克隆菌落,经IPTG诱导表达融合蛋白DLF,镍离子螯合层析纯化,用Western blot分析其抗原性.结果测序表明,插入片段可编码含545个氨基酸残基的融合蛋白DLF.SDS-PAGE分析表明,该融合蛋白可在大肠杆菌中表达,其表达量约占菌体总蛋白的20%,表达形式主要为包涵体.纯化后纯度达90%以上.Western blot证实,该融合蛋白同时具有DT和bFGF两种抗原性.结论已成功构建DT/bF-GF表达载体,并获得较纯的DLF融合毒素.
关键词： 白喉毒素 碱性成纤维细胞生长因子 免疫毒素 融合蛋白 -
抗肝癌hdsFv-hEDN重组免疫毒素的表达及生物学活性
目的制备对人肝癌细胞具有特异性杀伤活性的抗肝癌重组免疫毒素.方法利用大肠杆菌系统表达抗肝癌hdsFv-hEDN基因重组免疫毒素.表达产物经Ni-NTA亲和层析纯化后,进行特异性杀伤活性检测.结果抗肝癌hdsFvhEDN重组免疫毒素以可溶性形式表达于大肠杆菌培养上清中,并获得有效纯化.ELISA法检测证实其具有与相应抗原特异性结合的活性.细胞毒试验表明对肝癌细胞具有杀伤作用,而对正常肝细胞无损伤.结论已成功地制备了具有特异性结合和杀伤活性的抗肝癌hdsFv-hEDN基因重组免疫毒素,为其进一步应用奠定基础.
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重组免疫毒素IL-6(T23)-PE38KDEL在大肠杆菌中自诱导表达条件的优化
目的 优化重组免疫毒素IL-6(T23)-PE38KDEL在大肠杆菌中的自诱导表达条件,以提高菌体浓度及可溶性目的蛋白的表达量.方法 采用摇瓶培养,利用单因素和正交试验对工程菌自诱导的培养条件(接种量、诱导时间、诱导温度、装瓶量)和培养基组分(有机氮源、无机氮源、碳源、有机酸)进行优化,检测菌体浓度、可溶性目的蛋白的表达量及质粒稳定性.结果 确定适自诱导培养条件为装瓶量20ml/250ml、接种量2％,28℃诱导25 h;适自诱导培养基组分为:蛋白胨2％、酵母浸粉0.5％、Na2HPO425 mmol/L、KH2PO425 mmol/L、硫酸铵25 mmol/L、葡萄糖0.05％、甘露醇1％、乳糖0.6％、苹果酸钠20 mmol/L、MgSO40.5 mmol/L.此时可溶性目的蛋白的表达量和菌体浓度分别为LB培养基(IPTG诱导)的1.76和2.12倍,质粒稳定性由87％提高至98％.结论 优化了重组免疫毒素IL-6(T23)-PE38KDEL在大肠杆菌中的自诱导表达条件,为其工业化生产奠定了基础,也为自诱导在其他重组蛋白药物生产中的应用提供了参考.
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免疫毒素研究及临床应用进展(二)临床研究
免疫毒素的临床应用按肿瘤细胞表面靶抗原分类的不同予以排列,正在临床试验中的免疫毒素/嵌合毒素,见表1.
