首页 > 文献资料
-
抗膀胱癌重组免疫毒素的可溶性表达及其抗肿瘤活性
目的:构建抗膀胱癌重组免疫毒素BDI-1-PE38/KDEL的可溶性表达载体,并表达、纯化具有抗肿瘤活性的可溶性蛋白.方法:将抗膀胱癌重组免疫毒素BDI-1-PE38/KDEL的基因片段,插入含有大肠杆菌脯氨酰顺反异构酶FkpA基因的共表达载体pTMFK中,构建重组共表达载体pTMFK-IT.以重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)-Star,共表达目的蛋白与Fk-pA.表达产物以镍离子金属螯合层析柱及抗PE抗体亲和柱层析进行纯化.用ELISA检测免疫毒素的抗原结合活性,用噻唑蓝(MTT)法进行体外细胞杀伤实验.结果:成功地构建了抗膀胱癌免疫毒素基因与FkpA基因的共表达载体,并获得纯度较高的目的表达产物.纯化后的表达产物与BIU-87膀胱癌细胞膜抗原具有良好的特异性结合活性,对BIU-87膀胱癌细胞有明显的体外特异性杀伤作用.结论:获得了对膀胱癌细胞具有显著特异性杀伤活性的免疫毒素,为将其进一步应用于膀胱癌的靶向治疗研究奠定了基础.
-
二硫键稳定的抗肝癌单链抗体-PE38融合基因的构建、表达与功能检测
目的: 制备高特异性有杀伤活性的新型抗肝癌免疫毒素.方法: 应用适当的酶切位点, 将二硫键稳定的人源化抗肝癌单链抗体(dsFv)基因及PE38基因克隆入原核表达载体pTIG中.诱导表达上清经Ni-NTA亲和层析柱纯化, 用MTT比色法检测纯化表达产物的细胞毒活性. 结果: 目的融合蛋白在大肠杆菌中得到可溶性表达, 表达产物的Mr为66 000, 表达量占菌体总可溶性蛋白量的21%.细胞毒实验表明, 抗肝癌免疫毒素对肝癌细胞具有杀伤作用, 而对正常肝细胞无损伤. 结论: 抗肝癌dsFv与PE38融合基因的成功构建及表达, 为其作为抗肝癌药物的进一步研究打下了基础.
-
免疫毒素在白血病治疗中的应用
白血病是血液系统常见的恶性疾病,其治疗手段主要是联合化疗及骨髓干细胞的移植.尽管化疗和干细胞移植使白血病的预后有了明显改善,但仍然有相当比例的患者复发死亡,难治与耐药也是治愈白血病的重要障碍.此外化疗选择性较低,在杀伤白血病细胞的同时也对正常细胞造成较大的损害,同时贫血、出血和感染几率增加.免疫毒素[6,7]作为肿瘤导向治疗可在发挥治疗作用的同时明显减少对正常细胞的损伤,因此开展免疫毒素研究有重要意义,近来颇受关注,并成为白血病治疗研究中的一大热点.本文现将免疫毒素治疗白血病的研究进展简述如下.
-
人胰腺核糖核酸酶的基因克隆、蛋白表达与活性测定
目的:构建人胰腺核糖核酸酶(hpRNase)原核表达载体、获得纯化hpRNase蛋白,为构建乳腺癌单链免疫毒素奠定基础.方法:针对编码hpRNase成熟蛋白基因的cDNA序列设计相应的引物,通过反转录PCR技术,从一例胰腺切除患者的组织标本中,扩增出编码hpRNase成熟蛋白的cDNA序列,亚克隆入表达载体pPROEX-HTb;在大肠杆菌B121中经IPTG诱导融合蛋白表达,并用镍离子交换树脂进行蛋白纯化;通过RNA水解实验验证hpRNase重组蛋白的活性.结果:经PCR、酶切、测序等方法鉴定,hpRNase cDNA正确克隆入pPROEX-HTb表达载体;IPTG可诱导载体表达分子量约20 kD的蛋白产物,经Western blot验证可与抗hpRNase抗体发生特异性反应;经镍离子交换树脂纯化后的重组蛋白可有效降解RNA.结论:成功构建hpR-Nase原核表达载体,并获得有RNA降解活性的hpRNase重组蛋白,为进一步构建乳腺癌单链免疫毒素奠定了基础.
-
DT389-hbFGF免疫毒素的克隆与表达
目的:构建含有白喉毒素氨基端389个氨基酸的片断(DT389)人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF)的融合蛋白(DT389-hbFGF)表达质粒并表达该免疫毒素,为阻止白内障术后囊膜混浊寻找物质基础.方法:提取灭活的白喉杆菌DNA和12 wk胎脑皮质RNA,应用PCR技术分别扩增出编码DT389的基因片段及编码18kDahbFGF的基因全序列,将两基因先后插入表达载体中,构建含有DT389-hbFGF融合基因的表达质粒,测序后,转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,纯化并鉴定表达产物.结果:扩增后得到DT389基因片段及hbFGF全基因序列;构建了DT389-hbFGF融合基因的原核表达载体并成功表达.结论:DT389-hbFGF免疫毒素克隆表达的成功为药物抑制后发性白内障的研究奠定了物质基础.
关键词： 免疫毒素 白喉毒素 碱性成纤维细胞生长因子 -
抗肝癌单链抗体融合PE38重组免疫毒素的构建、表达及纯化
目的: 构建绿脓杆菌外毒素PE38融合人源化鼠抗肝癌单链抗体(hscFv)原核表达载体,并对其产物作初步纯化,检测其对人肝癌细胞系SMMC 7721的毒性作用. 方法: 采用基因工程原理,将PE38基因片段亚克隆入hscFv表达载体pGEX-4T-1中,重组克隆载体经酶切及DNA序列测定证实两片段连接正确;转化大肠杆菌JM109后,受IPTG诱导表达GST融合蛋白,产物包涵体经变性、复性及重折叠并经 GST 亲合层析柱层析、凝血酶消化后,得到纯化的hscFv-PE38融合蛋白.采用 MTT 法检测hscFv-PE38对SMMC 7721的杀伤作用. 结果: 实验成功构建了免疫毒素表达载体pGEX-4T-1-hscFv-PE38(以下简称pGEXh-PE38);诱导产物主要以包涵体形式存在,表达量为11%; 纯化的hscFv-PE38对SMMC 7721细胞系具有较明显的杀伤作用,大杀伤率为78%,IC50为0.386 mg*L-1. 结论: 人源化抗肝癌单链抗体与PE38重组免疫毒素的成功表达纯化及对人肝癌细胞系的试验结果,为进一步肝癌的导向治疗提供依据.
-
抗肝癌hdsFv融合hEDN重组免疫毒素对体外培养的人肝癌细胞的杀伤作用
目的:探讨重组免疫毒素hdsFv-hEDN在大肠杆菌中的可溶性表达和纯化,观察其体外杀伤作用.方法:利用IPTG诱导hdsFv- hEDN免疫毒素在大肠杆菌中的表达.诱导转化菌经超声碎菌、离心、Ni-NTA Agarose亲合层析等步骤纯化,并通过SDS-PAGE和Western-blot进行分析及检测.采用MTT比色法观察其对人肝癌细胞的杀伤作用.结果: IPTG诱导后,hdsFv- hEDN在大肠杆菌中获得了可溶性表达,表达量为8%.表达产物纯化后,纯度达到基本均一.MTT结果表明,其对人肝癌细胞具有一定的杀伤作用.结论:本研究实现了hdsFv- hEDN重组免疫毒素在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化,获得了具有一定杀伤作用的抗肝癌重组免疫毒素.
关键词： 肝细胞癌 免疫毒素 单链抗体 人嗜酸性细胞神经毒素 -
PE38与人源化抗肝癌单链抗体重组免疫毒素的构建及表达
目的:构建绿脓杆菌外毒素PE38融合人源化鼠抗肝癌单链抗体(hscFv)原核表达载体,对其产物作初步鉴定,为肝癌的导向治疗奠定基础.方法:采用分子克隆技术,PCR法扩增PE38基因片段,克隆入 GST-融合蛋白表达载体pGEX-4T-1-hscFv中,重组克隆载体经酶切及DNA序列测定证实两片段连接正确,受IPTG诱导表达后,SDS-PAGE及Western blot分析GST融合蛋白结果.结果:成功构建免疫毒素表达载体pGEX-4T-1-hscFv-PE38(以下简称pGEXh-PE38);SDS-PAGE清晰显示Mr为90 000的目的蛋白条带,光密度薄层扫描提示表达量为11%, Western blot在相同位置显示蛋白印迹,证实载体构建及表达均正确.结论:利用基因重组技术,在原核细胞中表达重组免疫毒素hscFv-PE38,为尝试肝癌治疗试验的一条有效途径.
-
抗胃癌单链抗体免疫毒素的制备及活性检测
目的对抗胃癌单链抗体免疫毒素基因重组质粒进行表达，进而获得有活性的单链抗体免疫毒素。方法应用IPTG诱导大肠杆菌表达系统进行单链抗体免疫毒素基因重组质粒的表达，并对产生的不溶性包涵体进行纯化，经变性、复性后，观察其生物学活性。结果诱导表达了约66KD的蛋白，分子量符合预计大小，以包涵体的形式存在于菌体中。经包涵体纯化、变性、复性，使其折叠为正确的空间结构，经检测可与胃癌细胞MGC803特异结合，并有一定的细胞毒性。结论获得了可与胃癌细胞系MGC803特异结合，并有一定的细胞毒性的抗胃癌单链抗体免疫毒素。
-
中华眼镜蛇细胞毒素及其偶联膀胱癌单克隆抗体的体外抑制膀胱癌细胞增殖的实验研究
目的 从中华眼镜蛇的四种细胞毒素(cytotoxins,CTXs)中筛选活性强的一种与膀胱癌单克隆抗体构建成免疫毒素(immunotoxin IT),并研究IT的体外抑制膀胱癌细胞增殖的活性.方法 [3H]-TdR掺入法检测CTXs对膀胱癌细胞株的抑制增殖作用,用双功能偶联剂将CTX-12与:BDI-1连接成IT,并用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、DAB染色法和[3H]-TdR掺入法鉴定和检测IT的活性.结果 四种CTXs对BIU-87和EJ细胞株均有抑制增殖的活性,CTX-12与BDI-1能够连接成IT,IT对BIU-87和EJ细胞株具有特异性结合性.且IT仍具有抑制肿瘤细胞增殖的活性,其BIU-87,EJ和Lovo细胞作用6h的IC50分别为97.12,85.28和193.4mg/L,而作用半小时更换培养液培养至6h的IC50分别为94.64,81.28和865mg/L.结论 四种CTXs对膀胱癌细胞株均有抑制增殖的活性,CTX-12与BDI-1连接的IT具有特异性抑制增殖的活性,IT和四种CTXs都有潜力成为新的抗膀胱癌药物.
-
蜂毒肽与变构hIL-2融合基因原核表达载体的构建
目的 构建蜂毒肽与人变构白细胞介素-2原核表达载体,为进一步研究该融合基因而奠定基础.方法 以本室构建质粒pGEX-4T-2/Melittin-IL-2(88Arg)为模板,设计引物,用PCR定点突变的方法将IL-2部分的125Cys突变为Ala,PCR产物与pMD18-T连接,转化大肠杆菌,小提质粒,DNA测序后再将目的片段连接于pET-15b,后酶切鉴定.结果 PCR产物542bp,构建质粒双酶切、DNA测序鉴定如预期.结论 成功构建蜂毒肽与人变构白细胞介素-2原核表达载体.
