首页 > 文献资料
-
葡萄糖神经酰胺合成酶siRNA表达载体的构建
目的:构建针对葡萄糖神经酰胺合成酶(GCS)mRNA的siRNA表达载体,并观察其对转染细胞中GCS表达的影响.方法:根据人GCS mRNA编码序列,设计并合成3对针对GCS的发卡状RNA的寡核苷酸,各64个碱基,退火后插入pSUPER EGFP载体重组构建RNAi质粒,进行双酶切及测序鉴定.重组质粒用脂质体包裹转染入SGC7901/VCR细胞,采用RT-PCR检测GCS mRNA表达水平的变化.结果:重组构建的载体经酶切鉴定与测序分析,显示特定位点靶序列与设计序列完全一致.转染SGC7901/VCR细胞后,GCS mRNA表达明显降低.结论:GCSsiRNA表达载体构建成功,并可有效抑制人胃癌耐药SGC7901/VCR细胞中GCS的表达,为后续研究及肿瘤的基因治疗奠定了基础.
关键词： 葡萄糖神经酰胺合成酶 siRNA 表达载体 胃肿瘤 -
ret基因真核表达载体的构建及其瞬时表达
目的:构建ret基因真核表达载体pcDNA3.0-RET,为制作转基因动物提供实验基础.方法:利用HandⅢ及NotⅠ限制性核酸内切酶,消化pSK-RET及pcDNA3.0空质粒,获得目的基因及相应载体;通过T4连接酶重组DNA;通过氨苄青霉素(Amp)抗性、酶切鉴定及DNA序列分析,确定阳性克隆.通过脂质体包裹转染NIH3T3细胞,采用Western blot方法检测载体的瞬时表达状况.结果:Amp抗性筛选阳性;酶切片段电泳分析在5 400 bp及3 300 bp处有明显条带;DNA序列分析提示重组基因与实际序列一致;Western blot结果显示175 000处有明显条带.结论:ret基因真核表达载体pcDNA3.0-RET构建成功,并可瞬时表达.
-
重组原核表达载体pGEX-4T-1-MAGE-1的构建及表达
目的:构建人肿瘤相关抗原MAGE-1基因原核表达载体.方法:从人肝细胞性肝癌组织中提取总RNA,RT-PCR扩增出MAGE-1基因.酶切鉴定后,将其插入pGEM-T载体,再克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-MAGE-1.将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导4 h,SDS-PAGE及凝胶密度扫描分析目的蛋白的表达情况.结果:RT-PCR扩增出长度为927 bp的MAGE-1基因.重组表达质粒pGEX-4T-1-MAGE-1转化大肠杆菌BL21(DE3)后经诱导表达,目的蛋白约57 000,占菌体总蛋白的23%.结论:成功构建出重组原核表达载体pGEX-4T-1-MAGE-1,该载体在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达.
-
hTERT片段真核表达质粒的构建
目的:构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)片段的真核表达质粒,方法:从肿瘤组织中提取总RNA,采用RT-PCR法扩增hTERT基因并克隆入PGEM-T Easy载体中,然后再亚克隆于pcDNA3.1真核表达载体,用PCR扩增及限制性酶切法筛选重组真核表达质粒,并以DNA测序鉴定.结果:PCR扩增及限制性酶切法证实重组真核表达质粒的构建成功.测序表明,hTERT基因片段与GenBank公布的相应基因同源性比较,核苷酸序列的同源性为98.73%,氨基酸序列的同源性为99.68%.结论:成功构建了hTERT真核表达质粒,为进一步研究与hTERT相关的抗肿瘤免疫治疗奠定了基础.
-
小鼠乳腺组织中组织型纤溶酶原激活剂乳腺特异性表达载体的瞬时表达
目的:验证所构建的组织型纤溶酶原激活剂(tPA)乳腺特异性表达载体pWTA能否在小鼠乳腺组织中瞬时表达.方法:采用直接注射法将pWTA DNA、pWTA DNA/脂质转染胺试剂LipofectamineTM2000复合物及PBS分别注射入妊娠末期小鼠乳腺组织.应用原位杂交技术,以地高辛标记的tPA cDNA为探针,观察pWTA在小鼠乳腺组织中的瞬时表达.结果:tPA表达阳性细胞散在分布于pWTA DNA及pWTA DNA/LipofectamineTM2000复合物注射小鼠部分乳腺腺泡,PBS注射组无阳性细胞.结论:载体pWTA能够在小鼠乳腺组织中特异性表达tPA.
关键词： 组织型纤溶酶原激活剂 小鼠 乳腺 瞬时表达 表达载体 -
乳清酸蛋白启动子克隆及其乳腺特异性表达载体的构建
目的:克隆乳清酸蛋白基因(WAP)启动子并构建其载体.方法:以PCR技术克隆WAP启动子2.4kbDNA片段和加poly A信号0.37kbDNA片段;应用体外连接技术,连接pBluescript质粒、WAP启动子和加poly A信号DNA片段;转化连接产物,以内切酶酶切、琼脂糖电泳鉴定阳性克隆,对插入片段进行序列分析.结果:琼脂糖电泳显示,WAP启动子和加poly A信号DNA片段克隆成功;内切酶酶切鉴定阳性克隆,酶切片段与预期长度一致.插入片段序列分析与文献报道一致.结论:WAP启动子克隆及其乳腺特异性表达载体pWA构建成功.
-
组织型纤溶酶原激活剂cDNA克隆及其乳腺特异性表达载体的构建
目的:克隆组织型纤溶酶原激活剂(tissue-type plasminogen activator,tPA)基因及构建其乳腺特异性表达载体.方法:以PCR技术克隆2.1kb tPA cDNA片段;应用体外连接技术,连接乳腺特异性表达载体pWA和2.1kb tPA cDNA片段;转化连接产物,以内切酶酶切、琼脂糖电泳及插入片段序列分析鉴定阳性克隆.结果:琼脂糖电泳显示,2.1kb tPA cDNA片段克隆成功;内切酶酶切片段与预期片段长度一致;插入片段序列与文献报道一致.结论:tPA基因克隆及其乳腺特异性表达载体构建成功.
关键词： 组织型纤溶酶原激活剂 乳腺生物反应器 表达载体 -
MCF-7细胞中组织型纤溶酶原激活剂乳腺特异性表达载体的瞬时表达
目的:验证所构建的组织型纤溶酶原激活剂(tPA)乳腺特异性表达载体pWTA在乳癌细胞系MCF-7中的瞬时表达.方法:用脂质转染胺试剂:opofectamineTM2000将pWTA DNA转染入乳癌细胞系MCF-7和食管癌细胞系Eca-109.应用原位杂交技术,以地高辛标记的tPA cDNA为探针,观察PWTA的瞬时表达.结果:不同浓度Lipo-fectamineTM2000MCF-7细胞原位杂交均为阳性;Eca-109细胞及未加转染液者未见阳性信号.结论:载体pWTA为tPA乳腺特异性表达载体.
关键词： 组织型纤溶酶原激活剂 瞬时表达 乳腺生物反应器 表达载体 -
肝素酶反义RNA真核表达载体的构建及鉴定
目的构建肝素酶(heparanase,Hpa)反义RNA真核表达载体.方法提取胃癌组织总RNA,按照GenBank中检索出的Hpa基因cDNA序列,设计并合成反义Hpa基因片段的引物,进行RT-PCR,并将扩增产物克隆至pGEM-T载体,PCR鉴定及测序证实后,双酶切pGEM-T-antiHpa重组体回收目的片段,再将其反向亚克隆到真核表达质粒pcDNA3.1中,并对阳性克隆进行酶切鉴定和测序分析.结果PCR扩增出的反义片段与预期长度相符.构建的Hpa反义RNA表达质粒pcDNA3.1-antiHpa,分别作PCR及双酶切(BamHⅠ和HindⅢ)鉴定,证实其中有目的片段完整插入,插入片段测序结果与反义Hpa序列设计完全一致.结论成功构建了Hpa反义RNA真核表达载体pcD-NA3.1-antiHpa,此结果为进一步研究Hpa蛋白分子的生物学功能和以Hpa为靶点的恶性肿瘤的基因治疗研究奠定了基础.
-
人源性Rab32荧光融合蛋白表达载体的构建及鉴定
目的 构建人源性Rab32荧光融合蛋白表达载体pEGFP-Rab32,并观察Rab32在人黑素细胞瘤细胞系A375中细胞定位情况.方法 收集并提取A375细胞中的总RNA,反转录成cDNA,以特异性引物扩增Rab32片段,经XhoI和KpnI双酶切聚合酶链反应(PCR)产物和pEGFP-C3表达载体,酶切产物经胶回收、连接后转化至感受态大肠杆菌DH5a中,挑取单克隆菌落进行菌液PCR鉴定、酶切鉴定和测序分析,以确定表达载体构建正确.将构建的重组质粒转染A375细胞,Western blot检测细胞中Rab32表达水平,激光共聚焦显微镜观察其细胞定位.结果 pEGFP-Rab32重组质粒经菌落PCR、双酶切和测序鉴定构建正确,转染A375细胞后,Western blot可检测出细胞中pEGFP-Rab32融合蛋白的表达,激光共聚焦显微镜观察到Rab32定位于细胞质中,且大量聚集于细胞核周围.结论 pEGFP-Rab32融合蛋白表达载体成功构建,并观察了Rab32在细胞中的定位,为进一步研究Rab32在黑素代谢中的作用奠定了良好的基础.
-
表达盒两侧不同核基质结合区序列介导表达载体的构建
目的 构建表达盒两侧含有不同来源核基质结合区(MAR)序列的载体pCCF-Bg,为进一步研究MAR的调控功能提供基础.方法 用限制酶酶切质粒pCCM-in,将切下的interferon-MAR片段连接至表达盒一侧含有globin-MAR的表达载体上,构建表达盒两侧含异源MAR的表达载体pCCF-Bg.结果 酶切及琼脂糖凝胶电泳证实所构建的载体pCCF-βg正确,pCCF-βg表达盒两侧分别含有interferon-MAR和globin-MAR片段.结论 成功构建了表达盒两侧含有不同来源的MAR片段的载体pCCF-βg.
-
重组中国仓鼠卵巢细胞表达系统高效表达载体研究进展
生物制药是21世纪高科技产业,治疗性重组蛋白的生产是生物制药的重要部分.宿主细胞以中国仓鼠卵巢(CHO)细胞用途为广泛,近70％宿主细胞是用CHO细胞表达系统生产的.影响外源蛋白在CHO细胞中表达的因素很多,其中表达载体是重要因素之一.构建重组CHO细胞表达系统高效表达载体可以利用核基质附着区、泛在染色质开放元件,构建特定位点重组载体系统,以及选择合适的内部核糖体进入位点及弱化筛选标记等实现.CHO细胞表达高效载体构建涉及多个因素,需要进行不同元件的优化,才可达到高效表达.
-
α病毒载体在肿瘤基因治疗中的应用
α病毒(Alphavirus)属于被膜病毒科,是单股正链RNA病毒,其家族多个成员已经被用作表达载体,广泛地应用于基因治疗和分子生物学研究领域.全文就α病毒载体生物学特性及其肿瘤基因治疗中的应用作一阐述.
-
银杏果抗真菌肽基因(GZ-gb)原核表达载体的构建
目的 为了构建贵州银杏果抗真菌肽基因(GZ-gb)的表达载体.方法 采用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切的pMD18-T-GZ-gb和pET32a(+)质粒,纯化回收产物进行反应,将连接产物pET32a(+)-GZ-gb转化大肠杆菌感受态细胞DH5a后,经菌落PCR、酶切鉴定和测序.结果 表明目的片段成功插入表达载体.结论 pET32a(+)-GZ-gb可以用来制备抗真菌蛋白.
关键词： 银杏果 抗真菌肽基因(GZ-gb) 表达载体 构建 -
人血小板生成素基因乳腺特异表达载体的构建和表达
目的 为了获得能在转基因动物乳汁中高效表达人血小板生成素(TPO)的特异表达载体.方法 将山羊β-乳球蛋白基因5'端上游-3.9 kb和-1.9 kb调控序列及β-酪蛋白启动子分别与人TPO基因连接,构建了pB3.9T、pB1.9T和pPT3个乳腺特异表达载体.将上述载体分别进行瞬间转染和稳定整合筛选实验,从mRNA及蛋白水平检测TPO基因的表达.结果 BLG3.9、BLG1.9和P1A3 3种调控元件都可以启动人TPO在乳腺细胞中特异表达.瞬时转染时3种载体表达水平依次为pPT＞pB3.9T＞pB1.9T.但当外源基因稳定整合入细胞基因组后,TPO表达量持续升高,且pB3.9T表达量明显超过另外两种载体.结论 证实了BLG转录子去阻遏和激活转变调节的存在,可能在其5'端-3.9 kb与-1.9 kb之间存在这一调节区域.并且与BLG1.9相比,BLG3.9能更有效地启动人TPO基因在乳腺细胞中的表达,也说明在-3.9至-1.9 kb之间可能存在特殊的增强序列.
-
siRNA表达载体的构建及其表达
本研究用限制性内切酶消化质粒pCMV-tag-2B,除去巨细胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)启动子核苷酸序列,剩下的核苷酸序列作为构建表达siRNA(Smallinterfering RNA,siRNA)载体的前体.依据文献提供的扩增H1 RNA启动子核苷酸序列的引物序列合成一对引物,以带有H1 RNA启动子序列的质粒DNA为模板扩增H1RNA启动子序列,插入前体,构建SiRNA的表达载体pCH1.另外将H1 RNA启动子插入pGEM-11fz相应位点,构建瞬时表达载体pGH1.依据EGFP的有效SiRNA抑制位点,合成两条分别为64bp的核苷酸链,通过体外退火,形成双链,然后插入已构建的两个表达载体.将这两个载体分别与表达EGFP蛋白的质粒pEGFP-N3共转染Bel-7402细胞,观察siRNA对EGFP的抑制效应.研究结果表明构建的载体有效表达了siRNA,这些载体可以用于与siRNA相关抗病毒治疗性试验研究.
-
pEGFP-HPV16E7重组融合蛋白质粒的构建及其表达
应用基因重组技术,构建增强绿色荧光蛋白(EGFP)与人乳头瘤病毒16型E7(HPV16E7)的重组融合表达质粒,经限制性内切酶酶切鉴定和PCR分析后,用基因转染技术将其导入小鼠肝癌细胞,荧光显微镜下观察融合蛋白的表达.酶切鉴定和PCR分析证实重组质粒中插入目的基因片段的大小、方向和插入位点均正确,在转染的小鼠肝癌细胞中观察到绿色荧光蛋白的表达.构建的pEGFP-HPV16E7融合表达质粒能直观地反映转染细胞中EGFP-HPV16E7融合蛋白的表达.由于转化率与表达率融为一体,故有利于对转染细胞的筛选,缩短转染细胞在体外的筛选的时间适用于对HPV16E7分子生物学特性、致瘤机理及APC提呈等的研究.为建立表达HPV16E7的实体瘤动物模型奠定了基础.
-
玉米蚜体内参与传毒的共生菌groEL基因的克隆和原核表达
以玉米蚜杨凌生物型为材料,设计特异性引物采用PCR的方法在国内首先克隆了一种玉米蚜体内参与传毒的共生菌groEL基因,序列测定结果表明:玉米蚜杨凌生物型共生菌groEL墓因全长为1647bp,编码548个氨基酸,登录Genebank,序列号为AF387863.构建了该基因的原核表达载体,用pBV221表达出63KDa的非融合目的蛋白,用pET-30a表达出69KDa的融合蛋白,二者均有较高的表达量.
-
注意杆状病毒科分类的变化
杆状病毒由于被广泛用作目的基因的表达载体倍受重视.近年来证实某些杆状病毒对虾具有致病性,从而成为研究热点之一.目前公认的重要的对虾致病病毒是对虾白斑综合征病毒(white spot syndromviruS,WSSV),在我国养殖对虾中广为流行,引致重大经济损失.不少文献将WSSV称作对虾白斑病杆状病毒,其实并不准确.
-
Livin 基因 siRNA 重组表达载体的构建
目的：构建针对人抑凋亡基因 Livin 的小干扰 RNA(siRNA)重组表达质粒载体。方法通过分子克隆技术,设计并合成具有基因特异性的3组寡核苷酸片段,克隆到 pmU6质粒载体,并经菌落 PCR 鉴定及测序鉴定,Livin 的 siRNA 序列成功克隆到重组表达质粒载体中。结果经菌落 PCR 鉴定及测序鉴定证实,人 Livin 的 siRNA 序列成功克隆到表达载体中,插入序列正确。结论成功构建了 Livin siRNA 质粒表达载体,为后续研究降低或沉默 Livin 基因表达后能否有效抑制膀胱癌细胞增殖和促进细胞凋亡奠定了基础。
