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shRNA表达载体的改建及鉴定
目的 通过改建pSilencer3.1-H1载体快速有效筛选重组shRNA表达载体,并可使线性化载体环化,长期保存.方法 制备含有单一限制性内切酶Not Ⅰ识别序列的双链DNA插入片段,与BamH Ⅰ和HindⅢ酶切线性化的shRNA表达载体pSilencer3.1-H1连接,构建载体pSilencer3.1-Ha/Not Ⅰ,再用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切pSilencer3.1-H1/Not Ⅰ,将含靶向目的 基因JAK2 siRNA表达框的DNA模板与其连接,构建pSilencer3.1-H1/JAK2的shRNA表达载体,提取质粒DNA,用Not Ⅰ进行单酶切,快速选择阳性克隆,选取不能被Not Ⅰ切开的质粒进行测序鉴定.随后将pSilencer3.1-H1/JAK2转染胃癌细胞系,用Western blot检测JAK2蛋白的表达.结果 通过测序证实pSilencer3.1-H1/Not Ⅰ和含JAK2 siRNA表达框的表达载体成功构建,将其转染胃癌细胞系AGS后,抑制了JAK2蛋白的表达.结论 通过对 pSilencer3.1-H1表达载体的改建可以快速有效地筛选shRNA表达载体.
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小发卡RNA抗呼吸道合胞病毒效应的研究
目的为从基因水平抑制呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)的复制,针对RSV的M2-2基因构建小发卡结构状RNA(short hairpin RNA,shRNA)重组质粒,在细胞水平观察shRNA对RSV复制的影响.方法将成功构建的针对RSV M2-2基因的重组质粒pshRNA8260转染HEp-2细胞,利用光镜观察pshRNA8260对RSV致HEp-2细胞病变效应(cytopathogenic effect,CPE)的影响并计算CPE抑制率,空斑形成实验检测RSV滴度变化.结果成功构建了针对人RSV M2-2基因mRNA的pshRNA8260重组质粒,研究发现pshRNA8260能明显改善RSV所致的病变效应,降低RSV在细胞内复制的病毒滴度.结论针对RSV M2-2基因的pshRNA8260重组质粒具有明显的特异性抗RSV效应的作用.
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RNA干扰对乙型肝炎病毒复制的体外影响
目的:通过一种能够在细胞内表达短发卡RNA的逆转录病毒载体来研究RNA干扰对乙型肝炎病毒复制的影响.方法:首先针对HBV基因组Pol基因RT区寻找RNAi的靶位,并设计相对应的寡核苷酸链.然后再将一对碱基配对寡核苷酸链退火后连接入载体形成重组的质粒,并进行鉴定.在Huh-7细胞中,将通过鉴定的干扰质粒与HBV复制型质粒pHBV3.8共转染,分别应用ELISA方法来检测HBV相关的抗原,应用Northern印迹检测HBV RNA,以及应用实时荧光定量PCR和Southern印迹检测HBV核心颗粒DNA.结果:研究通过计算机方法协助寻找了3条RNAi靶位,并且构建了相应的基于逆转录病毒载体的RNA干扰质粒154i、312i和734i.结果发现312i对pHBV3.8表达有明显的抑制,HBsAg和HBeAg分别为阴性对照组的39%和41%,差异均有显著性(P=0.001,P=0.000).定量荧光PCR结果显示312i组核心颗粒DNA水平显著低于阴性对照组(21.3%±1.1% vs100.0%±10.6%,P=0.0046).Southern blot和Northern blot结果均显示,312i组病毒复制及mRNA转录水平低(10.5%,12.0%).结论:在HBV基因组RT区找到了一个可用于RNAi的靶位,并且构建了相对应的干扰质粒,此质粒可成功地抑制HBV复制型质粒在细胞中的复制和表达.
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DNMT3 a基因shRNA质粒表达载体的构建及其沉默作用
目的：以DNMT3a mRNA 保守序列为靶基因设计针对DNMT3a mRNA的siRNA序列和无效干扰对照序列（HK），并利用基因重组技术将其克隆到真核表达载体pGensil－1中，构建pGenesil－1－DNMT3a－shRNA、pGenesil－1－HK－shRNA重组质粒。方法应用转化技术将重组质粒转化到大肠杆菌 DH5a中，通过卡那霉素抗性筛选出阳性菌落后提取质粒进行酶切和测序鉴定，应用质粒转染技术转染耐顺铂肺腺癌 A549细胞（ A549－DDP），利用RT－PCR技术检测转染重组质粒24、48、72 h后 DNMT3a的沉默效率。结果测序结果与合成序列一致，重组质粒不能够被PstⅠ切开，转染pGenesil－1－DNMT3a－shRNA能够明显抑制DNMT3a的表达，抑制率分别达到25．5％，56．2％，63．4％，且呈明显时间依赖性，而 pGenesil－1－HK－shRNA无明显抑制作用。结论成功构建了DNMT3a基因shRNA及HK质粒真核表达载体，为进一步实验研究奠定了基础。
关键词： DNMT3A RNA干扰 小发卡RNA 重组质粒 A549-DDP细胞株 -
YAP干扰质粒的构建及转染肺腺癌细胞A549的筛选鉴定
目的：构建YAP基因小发卡RNA（ shRNA），并转染人肺癌A549细胞株，建立稳定低表达YAP基因的肺癌细胞系。方法根据信息检索，分别构建4个shRNA（shRNA1，shRNA2，shRNA3，shRNA4）质粒表达载体和一个阴性对照表达载体（NCRNA），脂质体法转染人肺癌A549细胞株，荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达，有限稀释法建立稳定低表达YAP基因的A549细胞系，RT-PCR和Western印迹检测 YAP在该细胞中的表达。结果转染的细胞可见绿色荧光蛋白表达，RT-PCR和Western印迹检测到目的基因YAP在转染细胞中为低表达。 RT-PCR检测YAP mR-NA示shRNA1，shRNA2，shRNA3，shRNA4，NCRNA组和空白对照组的2-ΔΔct值分别为2．775，0．498，0．432，2．834，3．289，3．320。 Western印迹检测示shRNA1组，shRNA2组，shRNA3组，shRNA4，NCRNA组，空白对照组的蛋白相对灰度值分别为0．690，0．411，0．354，0．688，0．699，0．712。结论成功构建了靶向YAP基因的shRNA，筛选出了干扰作用为明显的shRNA，并建立了稳定低表达YAP基因的A549细胞系。
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双调控双功效溶瘤腺病毒的构建及意义
目的 构建表达Survivin基因小发卡RNA和内皮抑素基因的双调控双功效肿瘤特异性溶瘤腺病毒(CNHK500-shSRV-mE,以下简称双调控腺病毒),为肝癌的基因治疗奠定基础.方法 以人端粒酶逆转录酶启动子(hTERT)调控腺病毒E1a基因,缺氧调控元件序列(HRE)调控E1b基因,重组双调控双功效的肿瘤特异性溶瘤腺病毒载体；于E1区插入Survivin基因序列设计特异shRNA和全长内皮抑素基因构建双调控腺病毒.将双调控腺病毒分别感染人肝癌细胞株SMMC-7721、BEL-7402,观察病毒的增殖活性.结果 双调控腺病毒能在肝癌细胞中特异性高拷贝增殖,而在正常细胞系中几乎不增殖.结论 双调控腺病毒成功构建；其为肝癌的基因治疗奠定了基础.
关键词： Survivin基因 小发卡RNA 内皮抑素基因 腺病毒 肝细胞癌 -
慢病毒介导的shRNA靶向干扰mTOR基因表达的稳定小鼠成纤维细胞株的建立
背景 年龄相关性黄斑变性(AMD)是一种严重影响视力的眼病.前期的研究发现蛋白激酶/雷帕霉素靶蛋白(Akt/mTOR)通路的激活与AMD的发病机制密切相关,寻找特异性抑制mTOR通路的方法成为治疗AMD的突破点. 目的 建立稳定抑制mTOR基因表达的小鼠成纤维细胞株,为探讨Akt/mTOR信号通路在AMD发生和进展中的作用提供细胞模型,观察mTOR基因沉默对相关蛋白的影响.方法 根据鼠源mTOR mRNA序列设计并构建3对小发夹RNA(shRNA)干扰序列,分别与质粒GIPZ-GFP+Puro载体连接,构建重组质粒;将重组质粒与慢病毒包装质粒共同转染小鼠成纤维细胞株NIH/3T3细胞,经嘌呤霉素筛选并扩大培养后得到稳定细胞株,分别应用实时定量PCR和Western blot法检测NIH/3T3细胞中mTOR在基因及蛋白水平的表达变化,筛选出干扰效果佳的shRNA序列. 结果 慢病毒感染NIH/3T3细胞3d后,荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白(GFP)的表达,细胞的感染效率均达90％.实时定量PCR和Western blot检测显示,NIH/3T3细胞中mTOR mRNA和蛋白表达电泳条带清晰、单一;低感染复数(MOI)下,sh1组、sh2组和sh3组的NIH/3T3细胞敲低效率分别为31.3％、31.8％和45.3％,而在高MOI下,sh1、sh2和sh3的敲低效率分别为47.1％、56.5％和71.6％.Western blot检测发现,在低或高MOI下sh1、sh2和sh3 NIH/3T3细胞中mTOR蛋白的表达灰度条带均有不同程度的减弱,显示sh3为有效的干扰靶点. 结论 成功构建了mTOR慢病毒表达载体并建立了稳定抑制mTOR基因表达的NIH/3T3细胞株,为进一步研究mTOR基因在AMD小鼠发生中的作用提供了可靠的细胞模型.
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肝癌缺失基因-1和黏着斑激酶基因对肿瘤OVCAR-3细胞增殖和凋亡的影响
目的 观察肝癌缺失基因-1(DLC-1)和黏着斑激酶(FAK)对肿瘤OVCAR-3细胞增殖和凋亡的影响.方法 构建DLC-1表达载体、FAK特异性小发卡RNA(shRNA)载体和FAK-shRNA联合DLC-1表达载体,分别转染OVCAR-3细胞,应用实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)和Western blot检测OVCAR-3细胞中DLC-1和p-FAK(Y397)的表达,细胞计数试剂盒(CCK-8)和流式细胞仪检测细胞增殖和凋亡,Western blot检测磷酸化细胞外信号调节激酶1/2 (p-ERK1/2)的表达.结果 DLC-1表达增加或/和FAK基因沉默后,OVCAR-3细胞增殖显著受抑(0.737±0.094,P＜0.05)、凋亡明显增加(15.21±1.05)％ (P＜0.05),p-ERK1/2表达水平显著降低(0.151±0.010,P＜0.05).结论 DLC1可能通过调节FAK及其下游的ERK信号通路参与肿瘤细胞的增殖和凋亡.
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双调控双功效溶瘤腺病毒对肝癌的抑制作用
目的 观察表达Survivin基因小发卡RNA(shRNA)和内皮抑素基因(mE)的双调控双功效的肿瘤特异性溶瘤腺病毒在体内外实验中对肝癌的抗癌活性.方法 以重组的双调控双功效的肿瘤特异性溶瘤腺病毒感染肝癌细胞,Western blot鉴定肝癌细胞基因的蛋白表达,噻唑蓝(MTT)实验检测癌细胞增殖活性；建立肝癌裸鼠移植瘤模型,给予溶瘤腺病毒治疗,观察对移植瘤生长的抑制作用.结果 Western blot实验显示,CNHK500-shRNA-mE病毒增殖能够介导目的基因高效表达,有效抑制Survivin的表达；CNHK500-shRNA-mE感染肝癌细胞后,对肝癌细胞有特异性杀伤作用,在感染强度(MOI)=2时,CNHK.500-shRNA-mE感染组癌细胞存活率下降到50％以下,而对照病毒CNHK500-shRNA、CNHK500-mE、Ad-mE感染组癌细胞存活率均在80％左右；裸鼠SMMC-7721移植瘤模型经病毒治疗后,与对照组比较,CNHK500-shRNA-mE、CNHK500-shRNA、CNHK500-mE、Ad-mE的抑瘤率分别为77.41％ (P＜ 0.01)、59.27％ (P＜ 0.05)、35.96％ (P＜ 0.01)和25.94％ (P＜ 0.05),以CNHK500-shRNA-mE抑瘤作用强；CNHK500-shRNA-mE介导mE和shRNA高效表达,不但能够抑制间质肿瘤血管新生[对照组血管密度(MVD)=35.6±6.2,CNHK500-shRNA-mE组MVD=11.5 ±3.8,P＜0.01],而且大量诱导癌细胞凋亡[对照组凋亡率为(5.2±1.5)％,CNHK500-shRNA-mE组凋亡率为(26.3±7.5)％,P＜0.01].结论 携带shRNA和mE的双功效溶瘤腺病毒CNHK500-shRNA-mE比任一单功效腺病毒具有更强的肿瘤抑制作用.
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MACC1基因shRNA真核表达载体的构建及其在OVCAR-3细胞中的表达
目的:构建结肠癌转移相关基因1 (metastasis-associated in colon cancer-1,MACCl)小发卡RNA(small hair RNA,shRNA)的真核表达载体,观察其在卵巢癌细胞OVCAR-3中的表达.方法:设计、合成MACC1特异性shRNA序列,插入栽体p-super-EGFP-1中.重组栽体转染OVCAR-3,半定量RT-PCR和western blot技术检测转染前后OVCAR-3细胞中MACCl的表达.结果:成功构建MACC1 shRNA真核表达载体.转染后OVCAR-3细胞中MACCl的表达受到显著抑制.结论:成功构建MACC1特异性shRNA表达载体,为进一步研究MACC1参与卵巢癌发生发展的机制奠定实验基础.
