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反向重复序列法构建神经病靶标酯酶RNA干涉表达质粒
目的 构建基于通用真核表达载体的人神经病靶标酯酶双链RNA的稳定表达载体.方法 在正义和反义引物两端分别加上EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ的识别位点扩增得到神经病靶标酯酶活力域序列,构建含有目标基因的倒置重复序列的双链RNA表达载体pcDNA.NTE.dsRNA,酶切分析鉴定重组载体.脂质体法转染到Hela细胞中瞬时表达重组载体,酶活力测定其对细胞内神经病靶标酯酶活力的影响.结果 成功构建了NTE双链RNA稳定表达载体pcDNA.NTE.dsRNA,表达该载体细胞内NTE活力明显下降至对照细胞的20%左右.结论 采用反向重复序列法将靶标基因的编码序列正反向插入到通用真核细胞表达载体中,是构建哺乳细胞基因双链RNA稳定表达载体的有效方法.
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神经病靶标酯酶与Gβ2蛋白的相互作用
目的神经病靶标酯酶(NTE)被认为是有机磷引发迟发性神经毒性(OPIDN)的主要作用靶标,但NTE的生理功能并不清楚,妨碍了对OPIDN发生机制的阐明.本研究从信号转导角度出发,以期阐释NTE的生理功能,为揭示OPIDN的产生机制提供依据.
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氟丙胺磷对人成神经细胞瘤SK-N-SH细胞分化的毒性机制
目的 研究诱发迟发性神经病的氟丙胺磷对人成神经细胞瘤SK-N-SH细胞分化的影响及其作用机理.方法 MTT法测定细胞增殖,全反式维A酸诱导细胞分化,显微测量有机磷酸酯对细胞分化的影响,比色法测定NTE活力和Western印迹分析总的和磷酸化的神经纤丝重链蛋白以及肌动蛋白的表达.结果 50 μmol·L-1对氧磷和氟丙胺磷对细胞增殖没有影响;此浓度下对氧磷不抑制细胞的分化,而氟丙胺磷抑制细胞分化;氟丙胺磷抑制神经病靶标酯酶,而对氧磷对其不抑制;氟丙胺磷抑制总的和磷酸化的神经纤维丝重链蛋白的表达,而对氧磷对两种状态的神经纤维丝重链蛋白没有明显的作用.对氧磷和氟丙胺磷对肌动蛋白的表达都无影响.结论 氟丙胺磷对人成神经细胞瘤细胞分化的抑制是通过对总的和磷酸化的神经纤维丝重链蛋白表达的抑制实现的,并伴随着神经病靶标酯酶的抑制.
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神经病靶标酯酶相关性运动神经元疾病
神经病靶标酯酶(NTE)作为有机磷酸酯的靶标是在有机磷酸酯诱导的迟发性神经毒性(OPIDN)中被发现的,然而近年发现NTE基因的突变与一种运动神经元疾病(MND)的发生相关.本文就NTE、NTE突变引起的MND以及NTE突变引起MND的机制等方面进行了综述.
