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红色糖多孢菌ΔSACE_0065,ΔSACE_2559和ΔSACE_2565突变体构建及对孢子分化的影响
目的 构建红色糖多孢菌ΔSACE_0065、ΔSACE_2559和ΔSACE_2565三个突变体并研究其功能.方法 将待失活目的 基因的上下游同源片段依次连接到pUCTSR质粒Thio抗性基因(tsr)两侧,利用PEG介导的原生质体转化法将线性DNA同源片段转入红色糖多孢菌A226内,通过同源重组使目的 基因失活,后将构建出的三个突变株与出发菌株A226及ΔbldD突变株进行比较,观察孢子生长有无差异.结果 与结论 成功构建ΔSACE_0065、ΔSACE_2559和ΔSACE_2565三个突变株;与A226相比,ΔSACE_0065和ΔSACE_2559气生菌丝和孢子形成推迟,而ΔSACE_2565突变株的生长情况则无明显变化,提示红色糖多孢菌SACE_0065、SACE_2559基因参与其形态分化的调控.
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红霉素3"-O-甲基转移酶基因eryG克隆及表达
目的:探索红色糖多孢菌红霉素eryG基因在大肠杆菌中的佳表达条件.方法:以红色糖多孢菌总DNA为模板,PCR扩增出eryG基因序列,克隆到原核表达载体pET-22b(+)上,并使其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达.从诱导剂IPTG的终浓度和诱导时间两个因素来优化eryG基因的表达条件.结果:eryG基因可以在大肠杆菌中表达,表达产物EryG经SDS-PAGE分析相对分子质量约为33×103.表达条件经优化后,重组蛋白EryG表达量占菌体总蛋白的55%以上.结论:红色糖多孢菌红霉素eryG基因可以在大肠杆菌中高效地表达,为进一步研究EryG的相关酶学性质、分析其对红霉素发酵产物的影响奠定了基础.
关键词： 红色糖多孢菌 红霉素 3"-O-甲基转移酶 -
metK、vhbS和adpA的串联表达提高红色糖多孢菌红霉素产量的研究
目的：在红色糖多孢菌（ S．erythraea，SE）中串联表达S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因metK、透明颤菌血红蛋白基因vhbS和多效调控蛋白基因adpA，构建红霉素高产的工程菌株。方法通过PEG介导的原生质体转化方法，将携带metK、vhbS和adpA基因片段的整合型质粒导入红霉素野生菌株SE的A226及工业菌株WB中，安普霉素抗性筛选与PCR鉴定获得工程菌株，并利用枯草芽孢杆菌抑菌实验与高效液相色谱分析比较出发菌株及其工程菌株的红霉素产量。结果与结论成功构建4株A226衍生菌株A226-P1～P4与3株WB衍生菌株WB-P1～P3。相比野生菌株A226，工程菌株A226-P1～P4的相对红霉素效价提高了8％～25％，其红霉素A产量增加了64％～94％。同样，工程菌株WB-P1～P3的相对红霉素效价与红霉素A产量较出发菌株WB都有明显提高，分别增加了6％～10％与31％～62％。说明metK、vhbS和adpA的串联表达提高SE的红霉素产量具有普适性。
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红色糖多孢菌A226-YA突变体构建及产物分析
目的:用红色糖多孢菌(前称糖多孢红霉菌)KR6突变体合成酮内酯类化合物3-脱氧-3-羰基-红霉内酯B,同时,KR6突变体不合成红霉素.方法:以红色糖多孢菌A226基因组DNA为模板,用重叠PCR技术扩增KR6酶域中Tyr2699密码子TAC突变为Ala密码子GCC的1 000 bp DNA序列,克隆到载体pWHM3上构建同源重组质粒pWHM3-YA.将pWHM3-YA转化到A226中,并整合到红霉素合成基因座,经染色体二次重组后筛选TAC突变为GCC的突变体A226-YA,再进行突变体A226-YA产物分析.结果:通过染色体同源重组,构建了红色糖多孢菌突变菌株A226-YA,Zabspec Fab质谱分析结果显示A226-YA突变体合成了3-脱氧-3-羰基-红霉内酯B,而没有检测到红霉素.结论:突变Tyr2699能有效失活KR6,但3-脱氧-3-羰基-红霉内酯B的产量较低.
关键词： 红色糖多孢菌 聚酮合成酶 酮还原酶 3-脱氧-3-羰基-红霉内酯B -
产红霉素B红色糖多孢菌突变体的构建
目的:获得大量红霉素合成中间产物红霉素B,并进一步研究eryK基因的活性位点.方法:通过重叠PCR将eryK基因中包括BC环在内的关键氨基酸序列删除,克隆到同源重组质粒pWHM3上,继而通过染色体同源重组方法将EryK羟基化酶基因失活,构建了缺失C-12羟基化酶活性的红色糖多孢菌突变体.结果与结论:构建了红色糖多孢菌突变菌株AK17,对发酵产物进行TLC和MS分析,结果显示突变体主要合成红霉素B.
关键词： 细胞色素P450单加氧酶 红色糖多孢菌 eryK -
红色糖多孢菌C-12羟基化酶基因eryK的克隆及原核表达
目的:探讨红色糖多孢菌C-12羟基化酶基因eryK在大肠杆菌中的佳表达条件.方法:将eryK基因克隆到表达质粒pET-22b(+),使其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,并对装液量、接种量、诱导时间、IPTG浓度和FeCl3浓度等表达条件进行优化.结果与结论:SDS-PAGE电泳显示,在相对分子质量44×103处有EryK蛋白条带,其含量占菌体总蛋白的58%以上.证明高GC含量的红色糖多孢菌C-12羟基化酶基因EryK可以在大肠杆菌BL21(DE3)中高效地表达,为体外研究EryK酶学相关性质以及大规模发酵奠定了基础.
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红色糖多孢菌A226-SP突变体构建及代谢产物分析
目的:构建红色糖多孢菌突变菌株,生物合成酮内酯类抗生素.方法:利用反向PCR技术,扩增红色糖多孢菌KR6酮还原酶基因突变DNA片段SP(KR6酶中Gly1141 Ala1142替换成ScrPro),克隆于pWHM3上构建染色体同源重组质粒pWHM3-SP.通过PEG介导原生质体转化,将pWHM3-SP导入红色糖多孢菌中.经染色体二次重组后,筛选出1株红色糖多孢菌KR6酶突变菌株A226-SP.结果:DNA序列分析表明,A226-SP染色体上编码KR6酶中Gly1141Ala1142序列GGTGCG突变成SerPro编码序列AGCCCT.HPLC-HRMS分析证实A226-SP菌株合成了3-脱氧-3-羰基-红霉内酯B(DOEB),同时检测到其中间产物C18H34O6,但没有发现红霉素产物.结论:Gly1141 Ala1142位于KR6酮还原酶的重要功能位点,红色糖多孢菌A226-SP突变体可以合成酮内酯类化合物.
关键词： 红色糖多孢菌 酮还原酶 同源重组 3-脱氧-3-羰基-红霉内酯B -
红色糖多孢菌染色体基因快速失活技术研究及应用
孢菌ΔbldD基因突变体,合成红霉素产量显著降低,说明bldD参与红霉素合成基因调控.结论:红色糖多孢菌染色体快速同源重组基因失活技术,对于分析红色糖多孢菌基因功能具有重要作用.
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红色糖多孢菌表达载体pZW的构建
目的:对红色糖多孢菌染色体整合型表达载体pZMW进行改进,以提高表达载体稳定性和表达外源基因效率.方法:以pSET152和pET-22b(+)为出发质粒,用PCR方法从红色糖多孢菌染色体DNA上扩增红霉素抗性基因启动子PermE作为表达载体启动子,并利用pSET152质粒上链霉菌染色体整合位点(attP)和安普霉素抗性基因,构建了红色糖多孢菌表达载体pZW.结果:与pZMW相比,pZW表达载体只有1个大肠杆菌质粒复制子,质粒减小2 530 bp,同时在链霉菌属细菌和红色糖多孢菌中能够表达硫链丝菌肽抗性基因(thio)和荧光蛋白基因(EGFP).结论:pZW质粒能够在链霉菌属细菌和红色糖多孢菌中稳定表达外源基因.
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有机氮源质量优化对红色糖多孢菌发酵生产红霉素过程的影响
通过分析红色糖多孢菌发酵生产红霉素过程中有机氮源中的氨基酸含量,设计了一种新型复合有机氮源,充分搭配各种氨基酸,优化蛋白质质量.通过摇瓶试验,氮源优化后红霉素效价达4 611 u/ml,较未优化的对照提高了22.5％.进一步在50 L罐上进行放大试验,红霉素有效组分EryA含量为7 901 μg/ml,相比对照提高了9.4％,杂质组分EryB和EryC含量分别降低了17.9％和33.1％.
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vgb在红色糖多孢菌表达及生物活性的研究
利用基因工程技术对红色糖多孢菌进行改造,提高红霉素产率.用PCR技术克隆vgb,采用电穿孔法与红色糖多孢发酵菌染色体整合,鉴定采用Western blot与Southern blotting分析.VHb活性分析采用一氧化碳(CO)差示光谱法,红霉素效价测定采用管碟法.结果克隆了含vgb的红色糖多孢菌表达质粒(pBlueⅤ),筛选了重组红色糖多孢菌株.与原始菌株比较,重组菌株细胞发酵密度分别为1.37与2.82,红霉素效价分别为3.8与5.1,相当于重组菌株提高红霉素体积产率约29%.重组红色糖多孢发酵菌提高了红霉素产率,对解决抗生素工业和基因工程菌高密度发酵有良好的应用前景.
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运用高通量筛选技术优化红霉素A发酵的合成培养基
目的 设计并优化出一种适用于红霉素发酵的合成培养基.方法 利用单因素缺失实验设计来减少培养基组分,然后利用Plackett-Burman实验设计来优化组分浓度.上述实验都是采用高通量方法进行的.结果 初选取了38种与生长和次级代谢相关的物质;然后通过2次单因素缺失实验将培养基组分减少到了19种;后通过Plackett-Burman实验对19种组分的浓度进行了进一步优化,确定各物质的浓度.5L罐发酵结果表明本研究获得的优化后合成培养基生成的红霉素A产量是采用现有文献报道合成培养基得到红霉素A产量的13.6倍.结论 高通量筛选技术是一种快速有效的筛选方法,该方法适合于优化培养基的组分.采用本论文中得到合成培养基可以对红色糖多孢菌的胞内代谢特征和红霉素A合成的关键代谢因素进行深入分析,利用这些代谢特点和影响代谢的关键因素,本文可以更加理性地对红霉素A的发酵过程进行调控,进而提高工业红霉素A产量并降低生产成本.
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响应面法优化红霉素发酵培养基
采用响应面法对红色糖多孢菌产红霉素发酵培养基进行优化.用Minimum Run Equireolicated Res Ⅳ设计对初始发酵培养基添加的6个影响因素的效应进行评价,选择有显著影响的4个因素,即硫酸镁、甜菜碱、硫酸铜和氯化钴.再用陡爬坡实验为中心组合实验确定大响应区间,后经过响应面分析得到优化结果,硫酸镁0.106%(w/v),甜菜碱0.0185%(w/v),硫酸铜0.106mmol/L,氯化钴0.0003%(w/v).优化后红霉素生物效价比优化前提高了30%.
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红色糖多孢菌变温发酵生产红霉素的研究
考察了不同温度(29～34℃)对红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)合成红霉素(erythromycin)的影响,对不同温度下的发酵过程进行动力学特性分析,在此基础上提出了红霉素合成的变温培养方法:延滞期及对数期初期温度控制在33℃,发酵中期32℃,后期降温至29℃的条件下进行培养.采用此变温培养进行发酵,红霉素的化学效价和生物效价比恒温32℃培养对照组分别提高了24%和11.1%.
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豆油在红霉素发酵中的作用及作用机制的研究
红色糖多孢菌D在15L发酵罐的基础培养基和发酵过程中补加豆油,当基础培养基中豆油量加倍时,效价提高43.1%;发酵过程补加豆油罐的红霉素效价、生产强度和Yp/s比不补豆油的分别提高了69.7%、69.6%和63.8%.通过实验测定发现,发酵过程补加豆油后,异柠檬酸脱氢酶、甲基丙二酰CoA异构酶的比活以及α-酮戊二酸的量均高于不补加豆油时的值,而琥珀酸的量低于不补加豆油时的值.推测豆油经过红色糖多孢菌代谢后进入红霉素合成的一条可能途径:豆油经过代谢后进入TCA循环,并强化了TCA循环的通量,产生了大量α-酮戊二酸,再生成琥珀酰CoA,琥珀酰CoA在甲基丙二酰CoA异构酶的作用下生成甲基丙二酰CoA作为红霉素合成的前体.
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透明颤菌血红蛋白基因在红色糖多孢菌株中表达及对红霉素产量的影响
目的 利用已含有血红蛋白基因(vgb)的红色糖多孢基因工程重组菌,探讨vgb表达产物对重组糖多孢红霉菌提高红霉素产率的影响.方法 用SDS-PAGE、Western blot方法鉴定血红蛋白,用葡萄糖浓度与总蛋白质含量比较原始菌株与重组菌株的差别.结果 红色糖多孢基因工程重组菌与原始菌株比较,重组菌株发酵过程葡萄糖浓度的变化出现在第二时段(约38h),原始菌株达到了0.4g/L,而重组菌株只有0.25g/L;第三时段原始菌株出现了游离葡萄糖浓度高峰而重组菌株未出现.在两个菌株中生物物质浓度[以总蛋白质(g/L)表示]存在不同,重组菌株比原始菌株约低27%.红霉素效价,原始菌株和重组菌株分别为3.98和5.15g/L,相当于重组菌株提高红霉素体积产率约29%.结论 重组红色糖多孢菌表达了透明颤菌血红蛋白,提高了红霉素产率,对解决抗生素工业和基因工程菌高密度发酵有良好的应用前景.
