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5-氮胞苷诱导体外培养的胚胎干细胞向心肌样细胞分化
目的 研究5-氮胞苷(5-aza)体外诱导胚胎干细胞分化为心肌细胞的可行性.方法 将P19细胞接种于培养板中或铺有琼脂的培养板中,5μmol/L 5-aza培养7d后用不含5-aza的培养基继续培养.倒置显微镜观察细胞跳动情况,用免疫细胞化学、RT-PCR检测及电镜观察等方法鉴定细胞分化.结果 5-aza暴露结合悬浮培养可诱导P19细胞分化为有节律跳动的心肌细胞.分化的细胞表达心肌特异的GATA-4、α-MHC mRNA及α-sarcomeric actin、cTnT蛋白,同时透射电镜观察到细胞质内有明显的肌丝.结论 5-aza在体外可诱导胚胎干细胞向心肌样细胞分化,悬浮培养有助于细胞的心肌化过程.
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热处理延缓维甲酸诱导P19细胞的生长及向神经元分化
研究热环境对P19细胞生长和RA诱导的向神经元分化的影响,为探讨热环境刺激对神经系统发育的影响提供参考.成熟的P19细胞在热环境的条件下培养1h后,消化接种至培养皿中正常培养,于不同时间点取样分析细胞数目.热环境处理P19细胞后用维甲酸诱导分化4d,随后接种至培养皿中,参照神经元的原代培养方法培养12d,用神经元抗体免疫鉴定,计数不同培养时间NSE、NF阳性神经元在总体细胞中的比例.结果发现接受热处理的P19细胞贴壁不良,生长始终缓慢,说明热环境刺激阻止细胞生长分裂.P19细胞经RA诱导分化后出现类似神经细胞的突起和纤维网络,而热环境导致P19细胞向神经元分化明显迟缓,NF阳性细胞比例增加.
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P19细胞移植改善心肌梗死大鼠心功能
目的观察P19细胞植入大鼠心肌后成活、分化及对大鼠心功能的影响.方法 SD大鼠30只,随机分为移植组(n=20)和对照组(n=10).用液氮冷冻方法建立心肌梗死模型,梗死后立即将培养的P19细胞植入心肌梗死区及周边区,8周后观察植入细胞的成活、分化,并通过血流动力学各项指标评价细胞移植对心功能的改善情况.结果移植组免疫组化染色GATA-4、α-肌节肌动蛋白(α-sarcomeric actin)及肌细胞生成蛋白(myogenin)在成活移植细胞呈阳性,左室收缩压(LVSP)、左室等容期压力大变化速率(±dp/dtmax)明显高于对照组(P＜0.01),左室舒张末期压(LVEDP)明显低于对照组(P＜0.01).移植组有1例检测心功能时发现有偶发室性早搏.结论 P19细胞移植入心肌梗死区后能够成活并向心肌分化,可明显改善心肌梗死后大鼠的心功能;P19细胞可以作为研究心肌梗死细胞移植疗法的模型细胞.
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P19细胞心肌体外分化诱导条件的优化
目的 分别观察P19细胞心肌分化诱导中的几种影响因素,优化P19细胞心肌分化的诱导条件.方法 使用悬滴法或96孔板悬浮培养法制备细胞聚集体(aggregates),二甲基亚砜(DMSO)为诱导剂诱导P19细胞的心肌分化.普通光学显微镜下观察跳动的心肌细胞的产生来确定诱导是否成功,免疫荧光染色确认心肌特异性蛋白Tro-ponin T的表达,RT-PCR方法检测分化诱导后心肌细胞标志基因的表达情况.结果 使用96孔板悬浮培养法诱导细胞形成聚集体后转入贴壁培养阶段时细胞聚集体贴壁状态优于传统的悬滴法.DMSO的加入可以提高细胞形成聚集体后贴壁时细胞聚集体的完整性.1×10(7)～2×10(8)L-1的接种浓度下心肌细胞分化诱导效率较高.在可观察到跳动的心肌细胞之前即可检测到Troponin T的表达.结论 通过对细胞形成聚集体的诱导方法、诱导剂、接种浓度等因素的优化可以提高P19细胞的心肌分化效率,为开发高效心肌分化诱导法提供了条件.
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应用5-氮胞苷体外诱导P19细胞分化为心肌细胞
目的 探讨P19细胞体外经5-氮胞苷(5-aza)诱导向心肌细胞分化的特征.方法 将P19细胞接种于铺有琼脂的培养皿中,用含不同浓度5-aza的培养基诱导培养7d,细胞悬浮生长形成类胚体(EBs).将EBs用生长培养基黏附培养,观察细胞收缩情况;免疫细胞荧光检测α一横纹肌肌动蛋白(asarcomeric actin)、心肌肌钙蛋白(cTnT)的表达;RT-PCR检测GATA-4、a-MHC基因表达,鉴定细胞分化.结果 将5-aza诱导形成的:EBs黏附培养后,在EBs周围的生长晕中出现自发性节律收缩的细胞团片,α-sarcomeric:actin及cTnT染色阳性,表达GATA-4、αMHC基因.10μmol/L5-aza处理组心肌细胞分化率较高.结论 5-aza暴露结合悬浮培养可诱导P19细胞向心肌细胞分化,其分化与5-aza浓度有关.
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应用二甲基亚砜体外诱导P19细胞分化为心肌细胞
目的观察P19细胞经二甲基亚砜(DMSO)诱导及不同培养方法,培养形成细胞聚集体并向心肌分化的过程.方法将P19细胞接种于Petri塑料培养皿或铺有0.5%软琼脂的培养皿中,DMSO诱导悬浮培养7 d形成细胞聚集体,将聚集体用生长培养基黏附培养至19 d.观察细胞跳动情况,用α-sarcomeric actin、cardiac Troponin T(cTnT)抗体进行免疫组织化学染色,鉴定细胞分化.结果经DMSO诱导7d,将形成的细胞聚集体用生长培养基黏附培养至15 d,在聚集体周围的生长晕中出现自发性节律跳动的细胞团片,α-sarcomeric actin及cTnT染色阳性,至19d,阳性率分别可达26%和15%.结论 DMSO诱导结合聚集体形成培养方法可诱导P19细胞向心肌细胞分化,并出现自发性有节律跳动.
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催产素诱导P19细胞分化为心肌细胞的作用
目的 研究催产素(OT)在体外诱导P19细胞分化为心肌细胞中的作用.方法 将P19细胞用含crr的诱导培养基悬浮培养4d,取其形成的拟胚体(EBs)用不含OT的生长培养基贴壁培养10～12d.用免疫细胞化学、透射电镜等方法对分化的细胞进行鉴定.结果 EBs周边生长晕中部分细胞变形、伸长,呈放射状排列.免疫细胞化学染色显示,变形分化的细胞表达á-横纹肌肌动蛋白(á-SCA)和心肌肌钙蛋白T(cTnT),并以OT终浓度l×10-7mol/L的实验组阳性率高(P＜0.01).透射电镜观察分化细胞具有心肌细胞发育早期的超微结构特征.结论 在体外OT能够诱导P19细胞分化为早期的心肌细胞.
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pEGFP-N2-BMP2转染诱导P19细胞分化为心肌样细胞
目的 探讨真核表达质粒pEGFP-N2-BMP2转染P19细胞后能否诱导其分化为心肌样细胞.方法 实验分转染组和对照组,转染组以真核表达质粒pEGFP-N2-BMP2转染P19细胞并使骨形态发生蛋白2(BMP2)基因稳定表达,然后结合细胞聚集培养,对照组为培养的P19细胞.两组细胞聚集培养4d,形成聚集体后贴壁培养,于贴壁培养的4d、8d、12d、16d,免疫细胞化学和Western blotting方法检测心肌标志物心肌肌钙蛋白T (cTnT)和心肌肌动蛋白α;半定量RT-PCR检测心脏早期转录因子GATA-4和NKx2.5基因的表达.结果 转染组心肌肌钙蛋白T和心肌肌动蛋白α两种蛋白形成聚集体贴壁4d时无表达,8d、12d、16d出现表达,其表达随时间延长逐渐增强.取材各时间点之间有显著差异(P＜0.01).在转染诱导后4d时GATA-4、NKx2.5两个基因即出现弱的表达,随着时间延长,8d、12d、16d两个基因的表达逐渐增强.取材各时间点之间有显著差异(P＜0.01).对照组未发现心肌肌钙蛋白T和心肌肌动蛋白α两种蛋白的表达,亦未发现GATA-4、NKx2.5两个基因的表达.结论稳定表达BMP2基因的P19细胞可以分化为心肌样细胞,BMP2可能通过调控转录因子GATA-4、NKx2.5进而影响心肌肌钙蛋白T和心肌肌动蛋白α的表达.
关键词： pEGFP-N2-BMP2 基因转染 P19细胞 心肌细胞 免疫组织化学 -
骨形态发生蛋白2诱导P19细胞体外向心肌样细胞分化
目的 探讨骨形态发生蛋白2(BMP-2)诱导P19细胞形成细胞聚集体并向心肌细胞分化的作用.方法 将P19细胞接种于铺有0.5%软琼脂的培养皿中,BMP-2诱导悬浮培养4d形成细胞聚集体,将细胞聚集体用生长培养基黏附培养至19d.相差显微镜观察细胞形态学变化,应用免疫细胞化学、激光扫描共焦显微镜技术检测α-横纹肌肌动蛋白(α-sarcomeric actin)和心肌特异性肌钙蛋白T(C-TnT)的表达,透射电镜观察分化细胞的超微结构.结果 经BMP-2诱导悬浮培养24h后即可见多个悬浮的细胞团形成,至第4天形成细胞聚集体/类胚体(Ebs).将Ebs再用生长培养基黏附培养后,可见位于Ebs中央的细胞密集、颜色较深,为Ebs的内核.Ebs贴壁生长后 8h,细胞由Ebs边缘逐渐爬出,在周边形成单层的生长晕,中央细胞多层排列,增殖速度较快,细胞体积较小,具有高核质比,为未分化细胞.培养至11d后,细胞生长晕中一些细胞变形,胞体伸长,体积增大,呈放射状排列.培养至第19天,Ebs边缘生长晕中变形的细胞表达α-横放肌肌动蛋白和c-TnT蛋白.免疫荧光双标染色显示α-横纹肌肌动蛋白和C-TnT蛋白均定位于细胞质并且呈共表达.透射电镜下观察到,分化细胞呈杆状,细胞核呈卵圆形,位于细胞中央,细胞器丰富,并可见到平行排列的肌丝.结论 BMP-2暴露结合悬浮培养可以诱导P19细胞向心肌样细胞分化.
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P19细胞体外向脂肪细胞诱导分化的实验
目的 探讨应用96孔板悬浮法诱导P19细胞体外向脂肪细胞分化的可行性和有效性.方法 P19细胞使用96孔板悬浮培养法制备拟胚体(EBs),其中第3天至第5天使用诱导剂全反式维甲酸(RA).第7天挑取EBs用胰岛素和三碘甲状腺原氨酸诱导,继续贴壁培养20d后,油红O染色鉴定分化细胞的特征.结果 使用96孔板悬浮培养法可以形成大小均一的EBs,诱导结束后EBs生长晕周围部分细胞分化为脂肪细胞.细胞形态趋于类圆或圆形,胞质中出现小脂滴,可被油红O染色清晰显示.结论 使用96孔板悬浮法获得的P19细胞EBs在体外可诱导分化为脂肪细胞.
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生殖细胞核因子及Oct-4在P19细胞系诱导分化中的表达
目的 体外培养未成熟畸胎瘤细胞(P19细胞)并诱导分化,检测生殖细胞核因子(GCNF)及Oct-4在P19细胞诱导分化前后的表达.方法 用全反式维甲酸(ATRA)诱导P19细胞分化,通过间接免疫荧光染色和RT-PCR方法检测GCNF及Oct-4在P19细胞诱导分化前后的表达.结果 Oct-4在P19细胞诱导前呈强阳性表达,诱导2d后表达下降；而GCNF在P19细胞诱导前呈阴性表达,诱导2d后呈阳性表达.结论 GCNF参与了恶性生殖细胞肿瘤的体外分化.GCNF可能是通过下调Oct-4基因的表达参与了恶性生殖细胞肿瘤的分化.
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P19细胞向神经元诱导分化的实验研究
目的探讨P19细胞向神经元定向分化发育的可能性. 方法经维甲酸(RA)诱导4 d的P19细胞按神经细胞培养方法培养12 d,分别用NSE、MAP-2和TH进行免疫组织化学染色,用AchE进行组织化学染色,鉴定分化细胞的特征. 结果经RA诱导的P19细胞培养12 d,大多数细胞转变为类似于神经元的形态,长出突起并相互联络成网.经NSE免疫组织化学显示,12 d培养物中神经元约占89%.P19诱导的神经元培养12 d,神经元突起经MAP-2染色呈阳性反应.TH免疫组织化学显示,神经元中TH染色阳性神经元约占0.8%.组织化学显示,神经元中AchE染色阳性神经元约占71.09%. 结论 P19细胞在体外经定向诱导分化可以产生较高比例的神经元.
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P19细胞神经分化研究进展
哺乳动物神经系统的发育是一个复杂的过程,包含有多层次基因的表达与调节.P19胚胎瘤细胞系具有正常雄性小鼠染色体核型,在维甲酸的诱导下可向神经细胞方向分化,是研究神经发育机制的一个理想的细胞模型.本文就P19细胞﹑P19细胞的诱导、分化及参与P19细胞神经分化的相关因素做一综述.
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P19胚胎癌细胞体外定向心肌细胞分化模型的构建
目的:如何在体外将胚胎干细胞培育转化为大量的心肌细胞并进行移植,使之成为具有成熟心肌细胞功能?实验采用不同诱导剂对P19胚胎干细胞进行诱导,拟构建体外定向心肌细胞分化模型.方法:实验于2006-09/2007-03在日本东京工业大学生体分子机能工学研究室完成.①材料:P19细胞由日本东北大学加龄医学研究所提供.钙粘素融合蛋白N-cad-Fc由本研究室合成.②实验方法:P19细胞按1×107 L-1密度接种进行悬浮培养,分别以终浓度1,5,10,50,100 nmol/L视黄酸及0.5%、0.75%、1%、1.25%、1.5%二甲基亚砜各自诱导4 d,将形成的细胞聚集体分别接种于预铺有0.1%明胶、2.5mg/LN-cad-Fc、10mg/LN-cad-Fc基质的24孔板中培养10d.③实验评估:观察不同诱导条件及不同基质上的细胞跳动情况,免疫荧光染色检测心肌特异性蛋白Troponin T的表达,RT-PCR法检测心肌细胞标志性基因cardiac actin、gata-4的表达.结果:①P19细胞经1,5,10 nmol/L视黄酸或0.5%、0.75%、1%二甲基亚砜诱导后,均出现可自主节律跳动的细胞.P19细胞聚集体悬浮培养至20d,预铺有0.1%明胶、2.5mg/L N-cad-Fc及10mg/L N-cad-Fc基质的培养板上节律跳动细胞团的出现率分别为44.6%、71.3%和70.1%.②药物诱导后,P19细胞心肌特异性蛋白Troponin T呈阳性表达.③与传统预铺有明胶的培养板比较,在预铺有N-cad-Fc的培养板上心肌标志性基因cardiacacdn、gata-4的表达均明显升高,但10mg/LN-cad-Fc的表达量略低于2.5 mg/L N-cad-Fc.④分别在上述不同基质上单层培养的P19细胞,二甲基亚砜诱导14 d后均仍呈上皮样细胞形态,未见跳动细胞出现.RT-PCR检测无心肌标志性基因表达.结论:①使用0.5%～1%二甲基亚砜或1～10 nmol/L视黄酸可成功诱导P19细胞心肌分化,心肌特异性蛋白Troponin T的表达早于心肌跳动的出现.②作为一种基质模犁来模拟细胞间黏附,2.5 mg/L N-cad-Fc是较适宜P19细胞心肌分化的条件.③P19细胞心肌分化有赖于药物诱导和细胞成团的共同作用,细胞间黏附分子对其分化有促进作用.
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miR-2135对P19细胞增殖及向心肌细胞分化的作用
背景：既往研究发现，向心肌分化P19细胞中的miR-2135表达水平显著高于未分化P19细胞，但miR-2135对P19细胞增殖、向心肌细胞分化和心脏发育的影响尚不明确。
目的：探索miR-2135对P19细胞增殖及向心肌细胞分化的影响。
方法：分别以miR-2135沉默及空载质粒转染P19细胞，培养0-4 d，MTT法检测细胞增殖；培养0，24，48 h，流式细胞仪检测细胞周期。诱导两组转染的P19细胞向心肌细胞分化，诱导第0，10天，采用qRT-PCR检测P19细胞中miR-2135的表达；诱导第10天，采用蛋白免疫印迹检测心肌分化相关标志物心肌肌钙蛋白T、心房钠尿肽和心肌转录因子的表达。
结果与结论：①转染结果：转染miR-2135沉默质粒的P19细胞低表达miR-2135；②细胞增殖与周期：miR-2135沉默质粒转染P19细胞的增殖速度快于空载质粒转染P19细胞(P<0.05)，培养24，48 h的S期细胞比例明显高于空载质粒转染P19细胞(P<0.05)；③qRT-PCR检测结果：miR-2135沉默质粒转染P19细胞诱导10 d的miR-2135表达明显高于诱导0 d水平(P<0.01)；④蛋白免疫印迹检测结果：诱导10 d，miR-2135沉默质粒转染P19细胞心肌肌钙蛋白T、心房钠尿肽和心肌转录因子的表达明显低于空载质粒转染P19细胞；⑤结果表明：miR-2135抑制P19细胞的增殖，可促进其向心肌细胞分化。 -
过表达miR-32削弱多氯联苯抑制P19细胞向心肌细胞的分化
背景：多氯联苯对P19细胞分化成心肌细胞有抑制作用。miRNAs在多氯联苯抑制P19细胞分化成心肌细胞过程中发挥了重要的作用。
目的：探索miR-32在调节多氯联苯对P19细胞分化成心肌细胞中的作用。
方法：将P19细胞与1%二甲基亚砜和2.5μmol/L多氯联苯共孵育，通过Western blot鉴定分化标志物α-actinin、desmin、cTnI以及早期心脏发育的重要转录因子GATA4的变化。qRT-PCR鉴定多氯联苯对miR-32表达的影响。应用基因重组技术成功构建了小鼠miR-32真核表达载体，将其转染至P19细胞，与2.5μmol/L多氯联苯和1%二甲基亚砜共孵育，通过Western blot实验观察分化相关蛋白表达。
结果与结论：①多氯联苯降低了 miR-32的表达水平，抑制 P19细胞向心肌细胞的分化；②成功构建了小鼠miR-32真核表达载体，建立了稳定过表达miR-32的P19细胞系；③过表达miR-32发挥了削弱多氯联苯对P19细胞向心肌细胞分化的抑制作用。 -
miR-25对P19细胞向心肌细胞分化的影响及机制
背景：既往研究发现，miR-25在向心肌分化的P19细胞中的表达水平显著低于其在未分化的P19细胞中的表达水平，但是其对心脏发育的影响及其机制尚不明确。
目的：探索miR-25对P19细胞向心肌细胞分化的影响及其机制。
方法：体外培养P19细胞并向心肌细胞诱导分化。通过实时反转录PCR检测miR-25在向心肌分化的和未分化的P19细胞中的表达水平。通过脂质体转染构建miR-25过表达的P19细胞，观察miR-25对P19细胞向心肌细胞分化的影响。通过miRNA靶基因预测数据库预测miR-25的靶基因，并利用荧光素酶报告基因实验检测miR-25对Pax3的靶向作用，沉默Pax3，观察Pax3对P19细胞向心肌细胞分化的影响。
结果与结论：miR-25在分化的P19细胞中表达水平较低。miR-25过表达能够促进P19细胞向心肌细胞分化。靶基因预测分析Pax3为miR-25潜在的靶基因，荧光素酶实验进一步证实Pax3是miR-25的直接靶点，Pax3沉默促进P19细胞向心肌细胞分化。提示miR-25通过靶向Pax3促进P19细胞向心肌细胞分化，为心脏发育以及先天性心脏病的防治提供新的线索和理论依据。 -
内皮素1调控P19细胞向心脏传导细胞分化的机制
背景:内皮素1作为一种来源于心内膜和动脉血管内皮的旁分泌信号,能够诱导心脏传导细胞的分化成熟.目的:探讨内皮素1在体外诱导P19细胞向心脏传导细胞分化的作用.方法:P19 细胞分别与1%二甲基亚砜和100 nmol/L浓度内皮素1孵育,通过Western blot、免疫荧光和qRT-PCR鉴定早期心肌细胞特征性转录因子GATA4、MEF2C和心肌细胞分化标志物MHC-α、cTnT,以及重要的传导细胞转录因子Nkx2.5、Tbx5和分化标志物Cx40、ANP的变化.qRT-PCR鉴定内皮素1特异性受体阻断剂和阻断PI3K-AKT-mTOR信号通路对内皮素1诱导P19细胞分化的影响.结果与结论:①内皮素1能够上调P19细胞早期心肌转录因子、心肌结构基因和传导系统特征表型表达;②与二甲基亚砜相比,内皮素1能够确实诱导P19细胞向心脏传导细胞分化;③内皮素1主要通过ETA通路上调 Nkx2.5 和 Cx40表达水平从而诱导 P19细胞向传导细胞分化,ETB通路可能还参与了一条负反馈调节通路;④内皮素1能够通过PI3K-AKT-mTOR信号通路调控Nkx2.5表达进而影响传导细胞分化.
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NKX2-5诱导P19细胞向心肌分化的研究
目的 探索NKX2-5在心肌分化中的作用和机制.方法 实验分转染组和未转染组,转柒组为稳定表达NKX2-5的P19细胞,未转染组为P19细胞.两组细胞悬浮培养4 d,形成聚集体后贴壁培养,于贴壁培养的4 d、8 d、12 d、16 d,免疫荧光双标和Western blot检测横纹肌α肌动蛋白(α-SA)和心肌肌钙蛋白T(cTnT)的表达;取贴壁培养16 d的细胞透射电镜观察细胞超微结构变化.结果 转染组α-SA和cTnT两种蛋白在聚集体贴壁4 d时没有表达,8 d、12 d、16 d出现表达和共表达.转染组部分细胞出现幼稚的细胞连接和肌丝样结构;未转染组没有发现两种蛋白的表达,电镜观察未发现分化的细胞.结论 稳定表达NKX2-5基因的P19细胞可向心肌分化,但不适于作为心脏发育的体外模型.
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二甲基亚砜和5-氮胞苷诱导P19细胞转化为心肌细胞的效率
目的 分析二甲基亚砜(DMSO)和5-氮胞苷(5-Aza)诱导P19细胞转化为心肌细胞的效率,比较两者的区别.方法 将研究对象分为3组.一组使用常规方法对P19细胞进行培养,为阴性对照组；一组使用DMS01.0％进行诱导；一组使用5-Aza 10 μmol/L进行诱导.对所有研究对象使用RT-PCR法检测GATA-4基因相对表达量.结果 DMSO和5-Aza组诱导4d后,细胞均以克隆集落方式增殖,梭形细胞明显增多.8d出现自发性节律收缩的心肌样细胞.诱导后2 w,5-Aza组分化细胞明显多于DMSO组.RT-PCR法检测GATA-4基因相对表达量,除阴性对照组外,其他两组均表达心肌早期分化基因.每组15 d后表达量与本组7d表达量相比较均明显增加.此外,5-Aza组诱导28 d基因表达量明显高于DMSO组28 d.结论 DMS0 1.0％和5-Aza 10 μmol/L均可诱导P19细胞转化为心肌细胞,5-Aza 10 μmol/L的诱导效率高于DMS0 1.0％.
