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应用于双向电泳技术的不同软骨蛋白提取方案对比
目的 探索可兼顾双向电泳凝胶图像质量和结果保真性的软骨蛋白提取方案.方法 取股骨髁软骨(n=17).分别用软骨组织直接提取总蛋白(软骨组织组)、软骨组织提取总蛋白后CPC处理(软骨+CPC组)、直接分离软骨细胞提取总蛋白(直接软骨细胞组)或培养软骨细胞提取总蛋白(培养软骨细胞组)同步进行2-DE,对比不同方案产生凝胶图像质量和结果保真性的差异.结果 软骨组织组不能形成等电聚焦.软骨+CPC组可形成等电聚焦,但蛋白点数量偏少.直接软骨细胞组可获得与培养软骨细胞组媲美的高质量等电聚焦和凝胶图像,且在高分子量和偏碱区域分离出培养软骨细胞组缺如的部分蛋白点,质谱结果显示这些蛋白分别为Ⅵ型胶原、TGF-β2和annexin等骨关节炎病因学相关蛋白.结论 从软骨组织直接提取软骨细胞用于2-DE的方案在解决等电聚焦难题的同时,还避免了细胞培养对实验结果保真性的影响,是软骨相关疾病样本的2-DE研究优化处理方案.
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嗜麦芽寡养单胞菌所产金属β-内酰胺酶的特性
嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)是一种条件致病菌,对临床常用抗菌药物耐药.产金属β-内酰胺酶(MBL)使其对卡巴培南类及头孢菌素类耐药.我们采用纸片协同法筛选出产MBL的可疑菌株,以等电聚焦确定其等电点,并对MBL基因进行克隆、测序,从生化及分子水平了解嗜麦芽寡养单胞菌所产金属β-内酰胺酶的特性.
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结核中心结核分支杆菌Ag85A蛋白的克隆、表达及其血清学诊断价值的研究
10多年来国内、外学者一直从结核分支杆菌培养滤液中提纯蛋白质抗原进行多方面的研究,由于该方法制备蛋白抗原较烦琐、费时,因此,近年来许多研究者应用大肠杆菌来表达结核分支杆菌基因,简便地获得了大量结核分支杆菌单一的蛋白抗原.Ag85复合物是结核分支杆菌主要的分泌性蛋白,在结核分支杆菌H37Rv株中占分泌蛋白总量的30%,可从早期培养物中分离,是一种热不稳定的蛋白,经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和等电聚焦分析可分为Ag85A、Ag85B和Ag85C三个组分[1].因此本研究通过基因工程技术构建结核分支杆菌Ag85A表达株,获得重组Ag85A(rAg85A)蛋白,研究其免疫学特性,评价其在结核病血清学诊断中的价值,为研制更有效的结核病免疫诊断试剂和新型的结核病疫苗奠定了基础.
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等电聚焦电泳联合免疫印迹法检测寡克隆区带诊断神经系统炎性脱髓鞘疾病
目的 探讨等电聚焦电泳(IEF)联合免疫印迹法检测寡克隆区带(OB)在神经系统炎性脱髓鞘疾病(IDD)中的应用.方法 IEF联合免疫印迹法检测112例IDD及24例神经系统非炎性疾病(NIND)患者血清和脑脊液中OB,并进行对比分析.结果 与视神经脊髓炎(5/21,23.8%,x2=32.679)、急性播散性脑脊髓炎(1/4,Fisher精确检验)、系统性自身免疫病继发中枢神经系统IDD(3/19,15.8%,x2=37.425)、周围神经系统IDD(0,x2=51.944)和NIND(0,x2=51.944)患者比较,多发性硬化(MS)患者脑脊液OB阳性率(44/46,91.7%)显著升高(P<0.01).IEF联合免疫印迹法检测OB诊断MS的敏感度为91.7%,特异度为89.8%,高于其他检测方法.2例急性播散性脑脊髓炎患者和1例MS患者血清和脑脊液OB有相同条带,呈"镜像分布".结论 IEF联合免疫印迹法检测OB在MS诊断中具有一定的临床价值.
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人体尿液中新型促红细胞生成素受体激动剂的检测
促红细胞生成素类制剂(erythropoietin stimu- lating agents,ESAs)作为治疗肾性贫血的主要药物在临床中被广泛应用[1,2].由于其能促进血液中红细胞数量的增加,从而提高血液的载氧能力,也常常被竞技体育中某些耐力项目运动员滥用以提高运动成绩.这不仅违背了体育运动的公平性,也给运动员的健康带来了极大的损害[3].
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等电聚焦与凝胶电泳在多发性硬化寡克隆带检测中的比较研究
目的 比较等电聚焦(IEF与琼脂糖凝胶电泳(AGE)两种检测方法在多发性硬化寡克隆带检测中的差异.方法 对45例临床确诊的多发性硬化患者(传统经典型25例与视神经脊髓炎型20例),进行脑脊液和血液的IgG与白蛋白的检测,计算IgG指数.同时使用等电聚焦与凝胶电泳进行脑脊液寡克隆带检测.并对两种方法的敏感性进行比较.结果 45例患者中,24例(53%)为OB(IEF)阳性,而只有9例(20%)为OB(AGE)阳性,两者之间有显著性差异(P<0.01).结论 等电聚焦法为多发性硬化寡克隆区带较为敏感的检测方法.
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成像毛细管等电聚焦电泳分析糖蛋白类生物技术药物
目的 建立成像毛细管等电聚焦电泳分析糖白蛋类生物技术药物的异构体和等电点的方法.方法 应用优化的成像毛细管等电聚焦电泳技术,对3种糖蛋白类生物技术药物即聚乙二醇化重组人促红素(PEGlysated erythropoietin,PEG-EPO)、重组人组织型纤溶酶原激活剂TNK突变体(Recombinant human TNK mutant of tissue type plasminogen activator,rhTNK-tPA)和全人源化单抗A的异构体和等电点进行分析.结果 采用优化的成像毛细管等电聚焦电泳技术,可较好地分析PEG-EPO、rhTNK-tPA和全人源化单抗A的等电点和异构体,该方法可靠、快速,具有较好的分离度和重现性.结论 成像毛细管等电聚焦电泳技术可用于分析糖蛋白类生物技术药物的异构体和等电点,为保证糖蛋白类生物技术药物生产工艺的稳定性及质量控制提供了有效手段.
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双向电泳关键因素分析
蛋白质组学已成为继基因组学之后生命科学研究的重点,作为其"开门技术"的双向电泳也渐成为人们关注的焦点.本文总结了国内外研究进展,并对影响双向电泳的关键因素进行分析.
关键词: 双向电泳 固相pH梯度胶条 等电聚焦 SDS-PAGE二向电泳 -
牛凝血酶等电点的初步测定
作为一种新型的速效局部止血药和工具酶,凝血酶在临床和生物学研究中的应用十分广泛,牛血浆是其重要的来源之一.等电点沉淀是提取牛凝血酶首要和关键的步骤,测定其等电点后,再用此法时将得到更纯的凝血酶粗制品.本实验的目的是采用载体两性电解质pH梯度等电聚焦电泳的方法,结合SDS-PAGE测定牛凝血酶的等电点.经双向电泳后,SDS聚丙烯酰胺凝胶中出现了4个清晰的斑点,分别测定它们的分子量和等电点,其中一个斑点与牛凝血酶B链的分子量一致为32kDa,其等电点为5.19.
关键词: 牛凝血酶 等电点 等电聚焦 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 -
分析单克隆抗体电荷异质性的成像毛细管等电聚焦电泳技术平台方法的建立
目的 采用成像毛细管等电聚焦电泳技术(imaged capillary isoelectric focusing,iCIEF)建立分析单克隆抗体(单抗)电荷异质性的平台方法,并用不同亚型单抗(IgG1、IgG2、IgG4)确认该平台方法的适用性.方法 优化该平台方法的部分参数,包括两性电解质和阴极稳定剂体积、聚焦时间和尿素浓度.采用3种亚型单抗(IgG1、IgG2、IgG4)对该平台方法的专属性、精密度、线性、准确度和耐用性进行验证.结果 对样品(单抗)的处理条件为:3 mol/L尿素-0.5%甲基纤维素溶液70μl、两性电解质(pH3~10)4 μl、阴极稳定剂(500 mmol/L精氨酸)2 μl、等电点6.14和9.99 Marker各2μl,终完成0.2 mg/ml单抗(样品)的制备.检测参数:预聚焦1 500V、1 min,聚焦3 000V、8 min.该平台方法的专属性良好,制剂缓冲液对检测无干扰.重复检测6份平行样品以及不同分析员于不同时间检测12份样品各成分含量的相对标准偏差均符合规定的要求.单抗(样品)终浓度为0.1~0.3 mg/ml时,主要和酸性成分的线性决定系数(R2)≥0.99,碱性成分的线性R2≥0.98.该平台方法检测样品各成分的准确度为92%~105%.耐用性实验设计结果表明,两性电解质(pH3~10)体积和毛细管批次对该平台方法有显著影响.结论 建立的iCIEF平台方法分离度较高,精密度、准确度和耐用性良好,为单抗制品的电荷异质性表征和质量控制提供了更有效的工具.
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寄生于黄牛与水牛的肉孢子虫同工酶研究
目的比较几种肉孢子虫过氧化物酶、磷酸葡萄糖异构酶同工酶酶谱.方法将肉孢子虫包囊从黄牛和水牛肉中剖离,经超声粉碎、高速离心后取上清,聚丙烯酰胺垂直平板梯度凝胶电泳染色进行同工酶酶谱分析.结果黄牛和水牛的枯氏肉孢子虫两种酶酶带相似,其中过氧化物酶都出现7条带,位于pH6.98~4.41之间,磷酸葡萄糖异构酶出现6条带,pH位于6.53~4.66之间;黄牛和水牛的毛状肉孢子虫的两种酶酶带相似,其中过氧化物酶都出现5条带,pH位于7.15~4.97之间,磷酸葡萄糖异构酶出现4条带,pH位于6.51~4.70之间.枯氏肉孢子虫、毛状肉孢子虫、梭状肉孢子虫在同工酶酶谱上存在明显的差异,酶带数目、酶带的pH值分布均不同.结论同工酶谱分析证明黄牛和水牛都是枯氏肉孢子虫、毛状肉孢子虫自然中间宿主.枯氏肉孢子虫、毛状肉孢子、梭状肉孢子虫为不同的虫种.
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多房棘球绦虫原头节抗原的等电聚焦分析
[目的]了解多房棘球绦虫(E.m.)原头节粗抗原的组成成分.[方法]多房棘球绦虫原头节粗抗原经等电聚焦法分离、制备得到等电点各不相同的组分,各组分再通过SDS-PAGE电泳、考马斯亮蓝染色、凝胶分析仪分析其主要蛋白条带.[结果]所分离的20份组分pI值范围为4.0~8.5,主要蛋白条带有72/73、62/63、42/44、35/36、34及21/22 kDa.[结论]建立了多房棘球绦虫原头节粗抗原的分离方法并取得预期的分离结果.
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脑脊液寡克隆区带在神经系统疾病诊断中的意义
目的:探讨脑脊液寡克隆区带(CSF-OCB)在神经系统疾患中的临床意义,并对多发性硬化(MS)患者CSF-OCB阳性和阴性结果进行比较研究. 方法:收集398例神经系统疾患的脑脊液和血清标本,其中51例MS患者,用等电聚焦加免疫标记的方法进行OCB的检测. 结果:CSF-OCB阳性率在MS、神经系统炎性疾患及神经系统非炎性疾患中分别为35 .3%、39.6%及4.5%.MS患者CSF-OCB阳性率与临床类型、MS活动性、病程和应用激素等免疫抑制剂治疗有关.结论:CSF-OCB的检查对于MS和神经系统炎性疾患有一定的诊断价值.MS患者CSF-OCB阳性率较低与国内视神经脊髓炎所占比率较高有关;CS F-OCB的出现受到MS活动性的影响;也和MS病程演变阶段性相关;激素等免疫抑制剂的作用可能参与其中.
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二维凝胶电泳的新技术及其应用
1975年,O'Farrell以及Klose等人发明了双向凝胶电泳(two- dimensional gel electrophoresis, 2-DE),根据样品中蛋白质的两个重要理化特性:等电点(is-oelectric points, PI)和分子量( molecular weight, MW),将样品中的蛋白质进行分离.其原理是第一向基于蛋白质 PI不同用等电聚焦( isoelectric focusing, IEF)分离,第二向则按 MW的不同用聚丙烯酰胺十二烷基硫酸钠凝胶电泳( sodium dodecyl sulfate_polyacrylamide gel electrophoresis, SDS- PAGE)分离,把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开.其后的 25年中, 2- DE经过了多方面的改进,而且相应蛋白鉴定技术也得到了发展,这使得 2- DE广泛应用于蛋白质组学( proteomics)领域,成为研究"结构蛋白质组"与"功能蛋白质组"的有使用价值的方法,在蛋白质组研究中有着不可或缺的地位.现对 2- DE近期的进展及其应用作一综述.
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血清双向电泳研究中的失误分析及解决
双向凝胶电泳是蛋白质组学的一种基本技术,它以固相pH梯度等电聚焦进行第一向电泳,再用SDS-PAGE(sodiumdodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis)进行第二向电泳[1-2].由于其稳定性高、重复性好等特点,故它在血清样品研究中有独特的优点.但该方法操作步骤多,包括样品的处理、等电聚焦、胶条的平衡及转移、SDS-PAGE电泳及凝胶的染色等,同时每个步骤的操作要求较高.
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肾病综合征患儿载脂蛋白E遗传表型及与血脂水平的关系
目的:研究肾病综合征(NS)患儿载脂蛋白E (ApoE)等位基因频率分布及ApoE遗传多态性对血脂水平的影响.方法:NS患儿禁食12h,采静脉血,用等电聚焦电泳法测定ApoE遗传表型,酶法和免疫比浊法测定6项血脂指标.结果:NS患儿血清TG、TC、LDL-C、HDL-C、ApoB水平明显升高(P<0.001),Apoe4等位基因频率与健康儿童相比明显增高(P<0.05).NS患儿不同ApoE表型各项血脂指标均未见明显差异.结论:NS患儿存在明显脂质代谢紊乱,Apoe4等位基因频率明显增高.ApoE遗传多态性对NS患儿血脂水平未见明显影响.
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聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳法测定早孕因子的等电点
早孕因子是存在于妊娠早期母体血清中的一种免疫抑制因子,作为受精后早被检出且具有免疫调节活性的物质日益受到关注.我们从人工流产的血液中提取出早孕因子活性样物质.用聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳法测定其等电点.此方法操作简便,结果准确可靠,实验耗时短,无需昂贵仪器.1材料与方法[1-3]
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蛋白质分步提取法的建立及在大肠癌蛋白质组研究中的应用
利用等电聚焦/聚丙烯酰胺双向凝胶电泳(2-DE)对蛋白质进行分离是蛋白质研究的核心技术之一[1].目前常用的蛋白样品制备和提取方法存在一定缺陷,直接影响蛋白质组的分析结果.我们在大肠癌发生、发展的蛋白质组研究中,采用分步提取法,以3种分别适于溶解高、中、低、亲水性蛋白质的裂解液提取正常结直肠黏膜组织和癌组织中的蛋白质组成分,进行双向电泳,提高了蛋白质提取率和2-DE分辨率,现报道如下.
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黄牛与水牛的枯氏肉孢子虫同工酶研究
目的比较寄生于黄牛和水牛的枯氏肉孢子虫 (Sarcocystis cruzi)乳酸脱氢酶、磷酸葡萄糖变位酶、 6-磷酸葡萄糖脱氢酶、苹果酸酶四种同工酶的酶谱. 方法进行聚丙烯酰胺垂直平板梯度凝胶电泳的方法. 结果黄牛与水牛的枯氏肉孢子虫两种酶酶带相似,只在活性上略有差异. 结论同工酶谱分析证明黄牛和水牛都是枯氏肉孢子虫的自然中间宿主.
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儿童微小病变型肾病综合征尿蛋白组的双向电泳及PDQuest图像初步分析
微小病变型肾病约占儿童肾病综合征(NS)78%,我们以微小病变型肾病综合征的蛋白尿为研究对象,经条件优化后,以固相pH梯度(IPG)等电聚焦为第1向,SDS-PAGE均一胶(T=10%)的垂直电泳为第2向,即双向电泳(2DGE),对NS儿童的尿蛋白进行了研究.结果获得了满意的电泳图谱,将2DGE银染后,以扫描仪获取电泳图像,对图谱进行分析.