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GSK-3β过表达促进人胶质瘤细胞增殖及侵袭
目的 分析糖原合酶激酶-3(Glycogen Synthase Kinase-3β,GSK-3β)在胶质瘤细胞中的表达水平,探讨GSK-3β对胶质瘤细胞增殖、侵袭的影响及其作用机制.方法 RT-PCR及Western blot分析GSK-3β在人正常星形胶质细胞1800及A172、T98G、U87和U251 4种胶质瘤细胞中的表达水平;将构建的pcDNA3.1(+)-GSK-3β(rGSK-3β)重组表达载体及PAX3 siRNA转染人胶质瘤细U87,MTT法检细胞活力,Transwell小室检测细胞侵袭能力.结果 与1800细胞相比,4种胶质瘤细胞中GSK-3β的表达水平明显增高(P＜0.05).GSK-3β过表达促进了U87细胞的增殖,同时加强了侵袭细胞的数目(P＜0.05).分析表明,GSK-3β重组体转染显著加强细胞中PAX3的水平(P＜0.05);当用PAX3 siRNA转染沉默细胞中PAX3的水平后,GSK-3β过表达诱导的细胞的增殖及侵袭能力明显降低(P＜0.05).结论 GSK-3β在胶质瘤细胞中过表达,且有可能通过PAX3来调控胶质瘤细胞的增殖及侵袭.
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枝叶油联合维甲酸对SD胎鼠脑组织Pax3和缝隙连接蛋白43表达的影响
目的 探讨桉叶油联合维甲酸(RA)对SD胎鼠脑组织转录因子Pax3、缝隙连接蛋白43(Cx43)表达的影响.方法SD孕鼠42只,随机分为6组,每组7只,正常对照组,RA组,溶剂对照组(花生油+RA),3个实验组(桉叶油高、中、低剂量+RA).正常对照组自由摄食饮水,溶剂对照组于孕第7～14天每只花生油2ml灌胃,每天1次,孕第10天40mg/kg RA灌胃1次.桉叶油3个剂量组于孕第7～14天分别桉叶油300、200和100mg/kg灌胃,每天1次,孕第10天40mg/kg RA灌胃1次.RA组于孕第10天40mg/kg RA灌胃1次.各组于孕21天处死孕鼠取胚胎,Western blotting、免疫组织化学技术检测胎鼠脑组织的Pax3、Cx43蛋白的表达.Real-time PCR检测脑组织Pax3、Cx43 mRNA表达.阿利新蓝和茜素红进行骨骼染色,体视显微镜下观测椎骨发育,脊柱间隙.结果 维甲酸灌胃各组胎鼠椎骨数量异常的胎鼠数与正常对照组比较差异无显著性,但在维甲酸灌胃各组中,胎鼠椎骨形态异常的异常率和胎鼠椎骨分裂的百分率低值分别为55％(桉叶油高剂量+RA组)和45.8％(桉叶油低剂量+RA组),较正常对照组高(0)(P＜0.05).在维甲酸灌胃各组中,桉叶油各组胎鼠椎骨形态异常的异常率和胎鼠椎骨分裂的百分率高值分别为62.5％(桉叶油低剂量+RA组)和55.0％(桉叶油高剂量+RA组),较维甲酸组(73.7％,73.7％)和溶剂对照组低(68.2％,63.6％,P＜0.05).与正常组胎鼠比较,维甲酸灌胃各组大脑组织的Pax3、Cx43蛋白及其mRNA的表达较正常组高(P＜0.05),在维甲酸灌胃各组中,桉叶油灌胃各组胎鼠脑组织Pax3、Cx43蛋白及其mRNA的表达较单纯RA灌胃组低,其差异有统计学意义(P＜0.05).结论 桉叶油对维甲酸引起胎鼠神经管缺陷有一定的拮抗作用.其机制可能与桉叶油拮抗维甲酸上调胎鼠神经组织的Pax3、Cx43蛋白过度表达有关.
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过量维甲酸致小鼠神经管畸形及牛磺酸干预中Pax3的特异时相表达
目的 探讨小鼠胚胎神经管畸形(NTDs)中过量维甲酸(RA)致畸及牛磺酸干预的作用,分析Pax3与NTDs的关系及其特异性时相表达.方法 采用孕鼠服用过量RA及牛磺酸,建立胎鼠NTDs及干预动物模型；用免疫组化及逆转录聚合酶链式反应方法,分析各组胎鼠E9.5、E10.5、E11.5、E12.5中神经管Pax3的表达特异时相性差异.结果 致畸组胎鼠畸形率达到71.6％,而干预组畸形率降至55.3％(P＜0.05),两组死胎或吸收胎率分别为11.4％、9.8％(P＞0.05)；Pax3蛋白质阳性反应主要位于胞核,其在神经嵴表达强,而周围间充质表达弱.且在对照组中表达强于两实验组(P＜0.05),于E10.5 d出现表达高峰；在两实验组中Pax3表达呈现增强趋势,干预组Pax3表达强于致畸组(P ＜0.05)；Pax3基因在两实验组中的表达受抑,与对照组比较明显减弱(P＜0.05),对照组中Pax3基因的表达于E10.5 d出现高峰；在两实验组中Pax3随胚胎发育呈现增强趋势无表达高峰,干预组Pax3表达强于致畸组(P＜0.05).结论 RA致畸及牛磺酸干预在胚胎NTDs发生发展中的作用,与Pax3基因表达的时相差异性有关.
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一个Waardenburg综合征患儿家系的PAX3基因突变分析
目的：分析一个Waardenburg综合征患儿家系成员的临床表现和基因突变。方法收集1个Waardenburg综合征患者家系的临床资料，并对此家系5位成员的PAX3基因的蛋白编码序列进行测序分析。结果患儿及其母亲具有典型的Waardenburg综合征I型的听力障碍、内眦异位以及色素异常的临床特征，均携带PAX3基因ivs5-1G>A杂合致病突变；患儿父亲、外祖父母PAX3基因序列测序分析均未见异常。结论在一个Waardenburg综合征患儿家系发现未见报道的PAX3基因新发突变，基因诊断是确诊Waardenburg综合征型别的重要手段。
关键词： Waardenburg综合征 PAX3 突变 基因诊断 -
大豆异黄酮联合叶酸对胎鼠脑细胞Pax3和Cx43表达的影响
目的:观察大豆异黄酮联合叶酸对胎鼠脑细胞Pax3和Cx43表达的调控作用及其与神经管畸形发生的关系,并分析其可能的机制.方法:将72只孕鼠随机分为9组:对照组、模型组(环磷酰胺, CP组)、叶酸干预组(FA)、大豆异黄酮不同剂量干预组(SIF1、SIF2和SIF3)以及与FA配伍的大豆异黄酮联合干预组(SIF1+ FA、SIF2+FA和 SIF3+FA).SP免疫组化法检测胎鼠脑神经细胞Pax3及Cx43蛋白的表达,并观察胎鼠外观,记录胎鼠总数和畸胎数.结果:(1)与模型组比较,各干预组均能降低NTDs发生率,其中以FA+ SIF2联合干预组效果好;(2)与对照组比较,模型组中Pax3表达下调,Cx43表达过度;与模型组相比,各干预组均有Pax3表达上调,而Cx43表达下调的改变.结论:大豆异黄酮、叶酸或两者联合与NTDs形成相关基因Cx43的下调和Pax3的上调有关;Cx43的过度表达、Pax表达的下调可能是CP诱发NTDs 重要机制之一.
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miR-25对P19细胞向心肌细胞分化的影响及机制
背景：既往研究发现，miR-25在向心肌分化的P19细胞中的表达水平显著低于其在未分化的P19细胞中的表达水平，但是其对心脏发育的影响及其机制尚不明确。
目的：探索miR-25对P19细胞向心肌细胞分化的影响及其机制。
方法：体外培养P19细胞并向心肌细胞诱导分化。通过实时反转录PCR检测miR-25在向心肌分化的和未分化的P19细胞中的表达水平。通过脂质体转染构建miR-25过表达的P19细胞，观察miR-25对P19细胞向心肌细胞分化的影响。通过miRNA靶基因预测数据库预测miR-25的靶基因，并利用荧光素酶报告基因实验检测miR-25对Pax3的靶向作用，沉默Pax3，观察Pax3对P19细胞向心肌细胞分化的影响。
结果与结论：miR-25在分化的P19细胞中表达水平较低。miR-25过表达能够促进P19细胞向心肌细胞分化。靶基因预测分析Pax3为miR-25潜在的靶基因，荧光素酶实验进一步证实Pax3是miR-25的直接靶点，Pax3沉默促进P19细胞向心肌细胞分化。提示miR-25通过靶向Pax3促进P19细胞向心肌细胞分化，为心脏发育以及先天性心脏病的防治提供新的线索和理论依据。 -
Pax7和Pax3在胎儿咽、食管肌层中的表达
目的:探讨人胎儿咽、食管肌层中Pax7、Pax3表达及其空间分布.方法:采用免疫组织化学SABC法及蛋白印迹法对20例胎儿咽、食管的Pax7、Pax3表达进行观察.结果: Pax7定位咽、食管上、中段肌层,并主要表达在外部纵行肌,由上至下逐渐减少,至食管下段消失.而Pax3则在咽、食管阴性表达.结论:胎儿食管骨骼肌的分化沿着由上至食管下端的顺序分化,Pax7存于胎儿食管上、中段,支持了Pax7阳性细胞是食管骨骼肌肌祖细胞的假设.
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新型PAX3基因突变导致Waardenburg I型综合征
目的 报道一个Waardenburg I型综合征(waardenburg syndrome,WS)家系的新型PAX3突变.方法 通过全基因组测序的方法检测家系各成员的基因突变,结合遗传谱系分析研究其遗传特点.结果 该WS I型家系共有3代11位成员,结合临床诊断标准,先证者及其母亲确诊为WS I,结合基因组测序结果,两位患者以及先证者的外祖母存在PAX3基因c.358G>T突变,该突变为PAX3基因的新型突变,预测其可导致120Glu无义突变为终止子,从而致病.结论 该WS I家系存在一新型的PAX3突变,有一定的遗传指导意义.
关键词： Waardenburg综合症 PAX3 基因突变 -
应用改良的原位杂交方法分析Pax3基因在鸡胚脊髓中的表达
目的 改良传统的原位杂交方法,提高其信号强度和特异性;应用改良的原位杂交方法分析Pax3基因在鸡胚脊髓中的表达情况.方法 分子克隆Pax3 cDNA进入pCR-TopoII质粒,使用sp6 RNA聚合酶体外合成Pax3 cRNA反义探针,组织原位杂交分析Pax3(pairedbox3) mRNA在鸡胚脊髓内分布.结果 获得高质量的Pax3 cRNA探针,通过改进的原位杂交方法发现Pax3 mRNA在鸡胚脊髓内呈区域状特异分布.结论 改进的原位杂交方法显著提高了杂交信号特异性,Pax3在鸡胚脊髓内区域状表达显示Pax3基因在脊髓发育过程中扮演一定角色.
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PAX3基因重组真核细胞表达质粒的构建、表达及意义
目的：通过构建PAX3基因及其突变体表达质粒初步研究其外源性表达和定位表达，为研究Waar-denburg综合征（Waardenburg syndrome ，WS）发病机制提供实验基础。方法通过分子克隆技术双酶切pECE -PAX3和pcDNA3．0-HA后连接构建PAX3基因重组真核细胞表达质粒pcDNA3．0-PAX3-HA ，以其为模板分别构建PAX3基因新发突变H80D和H186fs表达质粒pcDNA3．0-H80D-HA和pcDNA3．0-H186fs-HA ， DNA测序鉴定。将PAX3、H80D和H186fs表达质粒分别瞬时转染小鼠胚胎成纤维细胞（NIH3T3细胞），采用Western blot和细胞免疫荧光法分别检测和观察野生PAX3蛋白和突变 H80D、H186fs蛋白在NIH3T3细胞中的表达和分布。结果 PAX3及其突变体 H80D和H186fs表达质粒经DNA测序鉴定序列正确，三者在NIH3T3细胞中正确表达，H80D与PAX3仅在细胞核中分布，H186fs在细胞质与细胞核中均有分布。结论本研究成功构建了PAX3基因及其突变体真核细胞表达质粒，突变对PAX3蛋白的亚细胞定位产生影响，为在体外实验进一步研究国人PAX3基因突变致WS发病的分子机制奠定了实验基础。
关键词： Waardengurg综合征 PAX3 基因突变 体外实验 -
Cx43和Pax3蛋白在人胚胎胃发育过程中的表达及意义
目的:探讨Cx43和Pax3蛋白在人胚胎发育早期胃体组织中的表达规律.方法:应用免疫组织化学SABC法检测第2、3、4月3个月龄段人胚胎胃体组织细胞中Cx43和Pax3蛋白阳性表达的积分吸光度（IA）.结果:2个月胎龄组胃体黏膜层组织中Cx43蛋白阳性细胞的IA值为154.2605±3.9513（n=5）, 3个月胎龄组IA值为150.3665±5.8285（n=6）,4个月胎龄组IA值为156.2175±2.0886（n=5）,可见IA值先降低再升高,差异显著（P＜0.01）.第2、3、4个月胎龄段,Pax3蛋白在人胚胎胃体肌层及黏膜层细胞均呈阳性表达.2个月胎龄组胃体组织中,Pax3蛋白阳性染色细胞的IA值为155.2775±4.0830（n=5）,3个月胎龄组IA值为155.9685±2.2745（n=6）,4个月胎龄组IA值为155.9275±1.9656（n=5）,差异无显著（P＞0.05）.结论:Cx43和Pax3蛋白在人胚胎早期胃组织的生长发育过程中起重要的调节作用.
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桉叶油含药血清联合维甲酸对体外培养神经干细胞Pax3及Cx43的影响
目的 探讨桉叶油联合维甲酸(RA)对神经干细胞Pax3、Cx43蛋白及基因表达水平的影响.方法 原代培养神经干细胞并进行鉴定,收集传代后第二代的神经干细胞,分别加入5％鼠血清(自由饮食SD大鼠血清,溶剂花生油灌胃鼠血清,桉叶油1500、1000、300 mg/kg灌胃鼠血清),5％鼠血清联合RA(5μmol/L)(自由饮食SD大鼠血清+RA,溶剂花生油灌胃鼠血清+RA,桉叶油1500、1000、300 mg/kg灌胃血清+RA)和RA(5μmol/L)培养48 h,收集细胞,提取蛋白,采用蛋白免疫印迹法(Western blotting)检测细胞Pax3、Cx43蛋白表达水平;提取RNA,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞Pax3、Cx43基因表达水平.结果 (1)用5％鼠血清作用于细胞后,与正常血清组比较,桉叶油含药血清各组的Cx43蛋白及mRNA表达水平均较高(P<0.05),Pax3蛋白及mRNA表达水平均较低(P<0.05),提示桉叶油含药血清具有上调细胞的Cx43蛋白及其mRNA表达,下调细胞Pax3蛋白和mRNA表达的作用.(2)用5％鼠血清联合RA作用于细胞后,与单纯RA组比较,血清各组Pax3蛋白及mRNA表达水平均降低(P<0.05);桉叶油含药血清各组的Pax3蛋白及mRNA表达水平均较正常血清组显著降低(P<0.05).(3)与单纯RA组比较,血清各组Cx43蛋白及mRNA表达水平均降低;但桉叶油含药血清各组的Cx43蛋白及mRNA表达水平与正常血清组比较,差异无统计学意义(P>0.05).结论 (1)桉叶油含药血清具有上调细胞的Cx43蛋白及其mRNA表达,下调细胞Pax3蛋白和mRNA表达的作用.(2)桉叶油含药血清具有拮抗RA上调细胞的Pax3、Cx43蛋白及其mRNA表达的作用.
