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KIR3DL1基因启动子亚克隆及表达调控载体的构建
为研究KIR3DL1基因的表达调控机制,亚克隆KIR3DL1基因的核心启动子序列,并构建KIR3DL1基因启动子-荧光素酶报告载体,采用PCR法从含有KIR3DL1基因转录起始位点5'侧翼区的质粒中扩增KIR3DL1基因核心启动子序列,产物纯化回收后与pGEM-T easy载体连接,测序鉴定正确的重组子经限制性内切酶BglⅡ和NcoⅠ双酶切后,插入同样经BglⅡ和NcoⅠ双酶切的用于基因表达调控研究的pGL3-Basic报告载体,终获得了长度为254bp的KIR3DL1基因启动子克隆,构建了调控荧光素酶报告基因的真核表达载体.通过酶切及基因测序的方法证实所构建的重组子是正确的,说明KIR3DL1基因启动子表达调控载体的构建是成功的.
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DNA甲基化调控K562细胞系kir3dll基因表达
为分析kir3dl1基因启动子区的甲基化模式及其与基因表达的关系,探讨kir3dl1基因的表达调控机制,采用亚硫酸氢盐测序法检测K562细胞中kir3dil基因启动子区的甲基化状况,应用甲基化抑制剂5-氮胞苷处理K562细胞以诱导CpG岛去甲基化,观察启动子区CpG岛甲基化与kir3dl1基因表达的关系.结果显示:K562细胞中kir3dl1基因核心启动子区CpG二核苷酸甲基化频率在20%-100%之间;K562细胞中kir3dl1基因启动子序列在转录因子E2F可能的结合位点上存在1个碱基的突变,并形成1个新的被甲基化的CpG二核苷酸;应用甲基化抑制荆5-氮胞苷可以诱导不表达kir3dl1基因的K562细胞重新表达该基因.结论:K562细胞中kir3dll基因表达受启动子甲基化调控,对转录因子E2F的深入研究有助于了解其在kir3dll基因表达调控中可能的作用.
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kir3dl1启动子表达调控载体的构建及其在K562细胞中的活性
为了分析kir3dl1基因核心启动子区域的功能并明确其表达调控机制,构建了kir3dl1基因启动子-荧光素酶报告载体,分析其在K562细胞中的活性.采用PCR方法从含有kir3dl1基因转录起始位点5'侧翼区的质粒中扩增kir3dl1基因核心启动子序列,插入经BglII和NcoI双酶切的荧光素酶报告载体pGL3-Basic;采用阳离子脂质体SuperFect包裹荧光素酶报告重组子转染K562细胞,应用双荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性;采用MTT法检测脂质体-DNA复合物对细胞存活率的影响.结果表明:成功构建了含有254 bp的kir3dl1基因核心启动子序列的荧光素酶报告重组子3DLl-luc254并通过酶切及基因测序方法的鉴定;荧光素酶报告重组子在K562细胞中的荧光素酶活性明显高于阴性对照,且荧光素酶活性、相对活性持续3天无明显衰减,转染了3DLl-luc254报告质粒的K562细胞存活率在76%-92%之间.结论:成功构建了kir3dl1基因启动子-荧光素酶报告载体,本研究采用的转染系统能够有效地在K562细胞中进行基因转染,kir3dl1基因核心启动子在K562细胞中具有较高活性.
