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细菌耐药机制的研究热点--整合子系统
在探讨细菌耐药机制的研究中,用基因突变和耐药性质粒介导细菌耐药性来解释似乎不够完全.近年来,细菌耐药机制--整合子(integron)系统得到研究者们的广泛注意[1],并取得了很大的进展.细菌通过整合子系统,通过整合酶的作用,捕获外来的耐药基因,并在位于整合子上游的启动子的作用下得到表达,使细菌具有耐药及多重耐药性.本文就近年国外相关文献及我们在对印度霍乱弧菌整合子分析的基础上,对整合子介导细菌耐药特性的研究进展进行简述.
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ABCG1基因多态对转录活性及冠心病易感性的影响
目的 探讨三磷酸腺苷结合盒子转运体G1(ATP binding cassette transporter,ABCG1)启动子多态性对其转录活性的影响及其与冠心病(coronary atherosclerotic disease,CAD)易感性的关系.方法 采用病例对照研究,对217例CAD患者和142例对照者的ABCG1近端启动子区转录启始位点上游约1 000bp核苷酸序列进行测序分析,分析CAD组和对照组、早发冠心病组和非早发冠心病组、多支病变组和单支病变组间单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)和单倍型的频率分布差异.采用等位基因特异引物测序或基因克隆测序鉴定启动子单倍型,选用双荧光素酶报告基因系统检测不同单倍型转录活性的差异.两组间的频率分布比较采用x2检验或Fisher精确检验,组间荧光素酶活性差异比较采用成组t检验或单因素方差分析.结果 在约1 000bp启动子序列中发现3个SNPs [-384 (A/G)、-204 (A/C)和-134 (T/G)],可形成ACG、GAT和GCG 3种单倍型,3个SNPs间强连锁不平衡,Tajima's D=2.655 (P＜0.01).3个SNPs频率和单倍型频率在CAD组和对照组间无统计学意义,与冠状动脉血管病变严重程度和早发冠心病无显著相关性.3种启动子单倍型的转录活性比较无统计学意义,但将GAT突变为GAG后,转录活性明显增强(P＜0.05).结论 ABCG1启动子A区的3个SNPs组成的3种单倍型对启动子活性无影响,该区域的SNPs及其组成的单倍型的频率分布与CAD的易感性无显著性相关.
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异丙酚对脂多糖诱导肺泡巨噬细胞高迁移率族蛋白B1启动子转录活性的影响
目的 探讨异丙酚对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导肺泡巨噬细胞(alveolar maerophages,AM)高迁移率族蛋白B1(high mobility group box l protein,HMGB1)启动子转录激活的影响.方法 以基因重组技术将HMGB1启动子克隆入荧光素酶报告基因表达载体pGl3-Basic,得到重组质粒pGL3-HMGB1P,采用脂质体介导的转染技术将质粒转染AM细胞.根据转染质粒和施加刺激的不同分为以下各组:未转染组;转染pGL3-Basic组;转染pGL3-HMGB1P组;转染pGL3-HMGB1P+LPS(100 mg/L)刺激组;转染pGL3-HMGB1P+LPS(100 mg/L)+异丙酚(5 mg/L)处理组.通过检测荧光素酶活性米观察启动子活性变化,分别采用Western blot和RT-PCR方法检测细胞HMGB1蛋白和mRNA的表达.应用单因素方差分析进行不同组别问的比较.结果 酶切和测序结果证实重组体pGL3-HMGB1P构建止确,荧光素酶活性检测显永pGL3-HMGB1P在AM细胞中有效表达.与转染pGL3-HMGB1P组比较,转染pGL3-HMGB1P+LPS刺激组HMGB1启动子的转录活性(423±27),HMGB1蛋白(0.49±0.03)和mRNA(0.48±0.04)的表达均显著增加(P＜0.05);与转染pGL3-HMGB1P+LPS刺激组比较,转染pGL3-HMGB1P+LPS+异丙酚处理组HMGB1启动子的转录活性(207±13),HMGB1蛋白(0.17±0.02)和mRNA(0.13±0.02)的表达均显著降低(P＜0.05).结论 异丙酚在转录水平通过抑制LPS诱导HMGB1启动子的转录激活而影响HMGB1的表达.
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乳腺癌BRCA1基因启动子区甲基化与蛋白表达及其与DNA甲基转移酶3a、3b的相关性分析
目的 分析探讨乳腺癌BRCA1基因启动子区甲基化与蛋白表达及其与DNA甲基转移酶3a、3b的相关性.方法 采取免疫组化法对27例乳腺纤维腺瘤以及198例散发性乳腺癌组织中的DNA甲基转移酶3a、3b蛋白的表达情况进行检测分析,对其中112例散发性乳腺癌组织中的BRCA1基因的启动子甲基化状态实施甲基化特异性PCR检测,同时收集各提供乳腺癌组织患者的相关临床资料.结果 198例散发性乳腺癌组织中有114例(57.6％)DNMMT3a蛋白阳性,有109例(55.1％)DNMMT3b蛋白阳性,乳腺癌组织中DNMMT3a蛋白的表达水平显著高于乳腺纤维腺瘤(P<0.05),而DNMMT3b蛋白的表达水平比较则无显著差异(P>0.05);BRCA1基因启动子区甲基化和DNMT3a表达呈正相关关系(r=0.223,P=0.019),而BRCA1蛋白表达水平和DNMT3a表达呈负相关关系(r=-0.169,P=0.019).结论 DNA甲基转移酶3a、3b蛋白的高水平表达现象与乳腺癌细胞的发病过程有相关性,DNA甲基转移酶3a蛋白通过参与BRCA1基因启动子区甲基化,使BRCA1蛋白表达水平降低,抑癌功能降低,从而导致散发性乳腺癌的发病.
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凝血酶激活纤溶抑制物基因启动子区-438A/G多态性与脑梗死的关系
目的 分析中国汉族人群凝血酶激活纤溶抑制物基因启动子区-438A/G(TAFI-438A/G)多态性与动脉粥样硬化性脑梗死(ACI)发病的关系.方法 225例ACI患者(病例组)和184例健康体检者(对照组)采用聚合酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性分析方法(PCR-RFLP)检测TAFI-438A/G多态性.结果 TAFI-438A/G基因型及等位基因频率在病例组与对照组之间无显著性差异.性别分层后,男性脑梗死组A等位基因频率为28.6%,高于对照组20.6%(P=0.039);AA基因型为9.0%,高于对照组1.9%(P=0.019) ;在女性中无显著性差异.结论 TAFI-438A/G可能与男性脑梗死的发病有关,AA基因型可能增加男性脑梗死患病风险.
关键词： 凝血酶激活纤溶抑制物 启动子 基因多态性 动脉粥样硬化 脑梗死 -
乙型肝炎病毒基因分型与前C基因和基本核心启动子突变分析
目的 研究乙型肝炎病毒(HBV)基因分型与前C基因及基本核心启动子(BCP)突变,为临床优化乙型肝炎治疗方案提供决策依据.方法 征集98例未接受过抗病毒治疗的慢性乙型肝炎(CHB)患者为研究对象.通过乙肝表面抗原(HBsAg)基因测序进行基因分型.同时对前C基因及BCP进行测序分析.结果 研究对象中HBV基因分型为:A:11例(11.2%);B:20例(20.4%);C:56例(57.1%);D:8例(8.2%);B/C混合型:3例(3.1%).与其他基因型相比较,基因B和C型的患病率较高.基因型C的前C基因突变率为46.9%(46/98),较其他基因型的高,差异具有统计学意义(x2=47.85,P<0.01);基因型C的BCP突变率为41.8%(41/98),较其他基因型的高,差异具有统计学意义(x2=67.14,P<0.01).结论 HBV基因分型以B、C基因为主.基因型C与BCP和前C基因突变密切相关.
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体外受精-胚胎移植患者卵巢颗粒细胞卵泡刺激素受体启动子突变与卵巢反应不良的关系
目的 探讨卵巢颗粒细胞卵泡刺激素受体(FSHR)启动子突变与卵巢反应不良发生的分子机制.方法 对体外受精-胚胎移植(IVF-ET)周期中70例卵巢反应不良患者与88例卵巢正常反应患者FSHR 5'端起始位点的前263 bp DNA片段进行测序,研究卵巢颗粒细胞FSHR启动子突变与卵巢反应性的关系.结果 158例IVF患者中有63例发生-29位点G→A突变,发生率为40.0%;其中,卵巢反应不良组中该位点突变发生率[60.0%(42/70)]明显高于卵巢正常反应组[23.9%(21/88),χ2=21.450,P<0.01];而不同基因型组的基础卵泡刺激素值(bFSH)差异无统计学意义[G/G基因型组为(7.2±2.3)U/L,G/A和A/A基因型组为(7.1±2.0)U/L,t=0.457,P0.05];G/G基因型组的窦状卵泡数目[(14.2±1.3)个]明显高于G/A和A/A基因型组[(4.5±0.8)个,t=35.81,P<0.05];G/G基因型组采卵数[(14.0±1.2)个]明显高于G/A＆A/A基因型组[(4.5±1.1)个,t=40.35,P<0.05];G/G基因型组雌二醇峰值[(2 865±557)pmol/L]明显高于G/A＆A/A基因型[(880±211)pmol/L,t=25.80,P<0.05];G/G基因型组成熟卵子数[(13.6±1.2)个]明显高于G/A&A/A基因型组[(4.3±0.9)个,t=40.22,P<0.05].结论 FSHR启动子-29位点对PSHR启动子活性有显著影响,G→A突变可减弱启动子活性,使卵巢颗粒细胞对PSH反应不良.
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耐药铜绿假单胞菌携带的整合子及其耐药基因盒检测分析
整合子系统是铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)产生耐药的重要因素,其包括5'保守序列(CS,包括整合酶基因int、重组位点att Ⅰ和1个启动子)和3'CS(由qacE△1和sul1组成);整合子携带的耐药基因盒包括1个单独的基因和1个下游的重组位点attC;整合子通过att Ⅰ和attC位点之间或2个attC位点之间的重组而捕获耐药基因.本研究对临床分离的13株耐药PA菌行药物敏感试验后,对整合子和基因盒的携带情况进行检测,并对序列、定位及质粒接合试验进行分析.
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DNA甲基化及其在肿瘤分子诊断中的前景
DNA甲基化是研究为深入的表观遗传学机制.该机制的异化可导致基因表达的异常及基因组稳定性的降低,继而促进肿瘤发生和发展.启动子CpG岛的高甲基化已被认为是与遗传性缺陷同等重要的、造成抑癌基因在肿瘤中失活的分子生物学机制.
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结直肠癌患者cdkn2/p16基因异常的检测及临床意义
肿瘤DNA存在于患者血液中,虽然含量极微,但可反映人体对肿瘤的负荷[1,2].ckdn2/p16基因是肿瘤抑制基因家族的重要成员,其功能异常多见于各种肿瘤;而其结构异常表现为缺失、点突变及启动子CpG岛的高度甲基化后,使其失活[3],不能转录和翻译.本研究对同一患者中ckdn2/p16基因几种异常单独或相互作用与病理分型和临床Duke's分期的相关性进行探讨.
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HBV前S缺失突变对病毒复制力及表面抗原启动子Ⅱ转录活性的下调作用
目的：分析HBV前S缺失突变病毒株体外复制力及其对表面抗原启动子（surface antigen promoter, SP）Ⅱ转录活性的影响。方法研究对象为119例解放军第三〇二医院的住院患者，包括38例慢性乙型肝炎（慢乙肝）轻中度、40例慢乙肝重度和41例慢加急性肝衰竭。从患者血清中提取HBV DNA，PCR扩增HBV全长基因组，统计前S缺失突变的发生率。挑选代表前S缺失突变株及其相应对照的HBV全长序列克隆至pGEM-Teasy载体中。用BspQⅠ/ScaⅠ双酶切1.0倍HBV基因组，转染HepG2细胞，72 h后检测病毒复制力；用PCR分别扩增含前S缺失突变型和野生型的HBV SPⅡ启动子片段，构建pGL3-SPⅡ双荧光素酶真核报告表达载体，转染HepG2细胞48 h后检测相对荧光素酶活性，分析前S1缺失突变对重叠的SPⅡ荧光素酶表达的影响。结果①HBV基因组前S缺失突变检出率在慢乙肝轻中度、慢乙肝重度和慢加急性肝衰竭3组中逐渐递增，分别为5.3%、12.5%和24.4%，差异有统计学意义（P<0.05）；②前S缺失突变病毒株的复制力较相应野生株降低69%；③与野生型相比，前S1缺失突变使重叠的SPⅡ转录活性降低了36%。结论 HBV前S缺失突变发生率随乙肝进展而升高，前S缺失突变株复制力降低，导致重叠的SPⅡ转录活性降低。
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新基因TAHCCP1编码蛋白对NS3TP6基因启动子转录活性的调节
目的 探讨丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白反式激活基因TAHCCP1编码蛋白对NS3TP6启动子转录活性的调节.方法 以我室前期克隆的TAHCCP1基因表达谱芯片结果为基础,利用生物信息学方法确定NS3TP6基因的启动子区域(NS3TP6-p),聚合酶链反应(PCR)扩增并克隆至真核报告载体pCAT3-basic中,构建重组报告质粒pCAT3-NS3TP6-p;以该质粒单独或与pcDNA3.1(-)-TAHCCP1共转染肝癌细胞系HepG2细胞,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性;观察细胞中表达的TAHCCP1蛋白对NS3TP6启动子转录活性的调节.结果 构建的重组表达载体pCAT3-NS3TP6-p在HepG2细胞中能够启动报告基因CAT表达,表明克隆的NS3TP6启动子有指导下游基因转录表达的活性;共转染实验中pCAT3-NS3TP6-p与pcDNA3.1(-)-TAHCCP1组CAT的表达活性是对照组的3.1倍,说明TAHCCP1蛋白能够在转录水平反式激活NS3TP6基因启动子活性.结论 本实验验证了基因芯片的实验结果准确性,进一步完善了新基因TAHCCP1的生物学功能,为深入理解HCV核心蛋白的反式激活调节机制提供了新的依据.
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心肌肌凝蛋白重链启动子的心血管组织特异性基因表达及其活性
目的探讨心肌肌凝蛋白重链(cMHC)基因启动子的心血管组织特异性及其表达活性,构建心血管组织靶向性表达的基因载体.方法分别采用PCR法合成大鼠cMHC基因启动子片段(-1600～+32)和酶切法获得CMV启动子片段,以取代pAdSV4nlacZ载体中的LTR启动子,获得pAdSV4nlacZ、pAdMHCnlacZ和pAdCMVnlacZ.上述载体分别转染培养的大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)、心肌细胞(CM)、心肌成纤维细胞(CF)和人胚肾细胞(293细胞),观察lac Z基因在上述细胞中的表达活性.结果β-半乳糖苷酶活性在pAdSV4nlacZ和pAdCMVnlacZ转染的各组细胞间无显著差异;pAdMHCnlacZ在转染的CM中lac Z基因的表达明显高于其他各组细胞,β-半乳糖苷酶活性在VSMC组低于CM组,高于CF和293细胞(%P%<0.01),在CF和293细胞间无差异(%P%>0.05).结论 cMHC启动子的转录活性相对低于CMV启动子和LTR启动子,而在CM和VSMC中的表达活性高于CF和293细胞,具有良好的心血管组织定向表达能力,适合用于心血管疾病的基因治疗.
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hAFP增强子调控的肝癌特异性基因治疗载体的构建及活性测定
目的:构建新型AFP顺式作用元件调控的基因表达载体,检测该调控元件的特异性和活性表达.方法:设计含有特定酶切位点的引物,采用PCR法从HepG2细胞中克隆AFP启动子及增强子基因亚区片段.启动子与增强子长、短片段分别与含有报告基因荧光素酶基因的载体pGL-3的多克隆位点连接,构建不同长度hAFP增强子调控的肝癌特异性Luciferase表达载体APSE-Luc/APLE-Luc.经测序,PCR及酶切鉴定各重组体.用脂质体法将表达载体转染表达或不表达AFP的肿瘤细胞系进行荧光强度及特异性表达测定.结果:成功地将AFP基因启动子、增强子克隆到报告基因载体pGL-3的多克隆位点,构建成为不同长度hAFP增强子调控的肝癌特异性Luciferase表达载体APSE-Luc/APLE-Luc,酶切鉴定和DNA序列分析无误.转染APLE-Luc质粒的细胞中Luciferase表达量明显高于转染APSE-Luc质粒的细胞,其在HepG2细胞中的表达明显高于SMMC7721细胞及Hela细胞.结论:成功构建AFP启动子与增强子联合调控载体APSE-Luc/APLE-Luc.AFP增强子能够特异性地增强目的基因在AFP阳性细胞中表达,并且不同的亚区活性不同,长片段的活性明显高于短片段.
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pGL3-Basic-COX-2-promoter:报告基因重组质粒的构建及其功能鉴定
目的:构建COX-2基因启动子荧光素酶报告基因重组质粒 pGL3-Basic-COX-2-promoter,并进行功能鉴定.方法:根据已知人的COX-2基因启动子序列设计两端引物,扩增人基因组DNA中的COX-2启动子.载体质粒pGL3-Basic和COX-2启动子分别用限制性内切酶HindⅢ和Bgl Ⅱ 双酶切,将COX-2基因启动子插入到pGL3-Basic报告载体中.构建的pGL3-Basie-COX-2-promoter重组质粒和内参质粒pRL-SV40瞬时共转染胃癌MKN45细胞,加入100倍细胞数量的Hpylori共培养不同时间后,检测双荧光素酶的活性.结果:成功构建COX-2基因启动子重组质粒pGL3-Basie-COX-2-promoter,质粒测序及酶切结果完全正确.瞬时转染实验显示,COX-2启动子在MKN45细胞中的转录表达随时间的变化而升高,转染后40 h的双报告基因活性是转染后8 h的3.5倍(P＜0.01);加入Hpylori共培养后,同时间点的荧光素酶活性明显升高(P＜0.05或0.01),转染后40 h的活性是转染后8h的5倍(P＜0.01).结论:pGL3-Basic-COX-2-promoter在胃癌MKN45细胞中能被转录激活,加入Hpylon刺激后COX-2活性显著增强,pGL3-Basic-COX-2-promoter可以用来鉴定和检测细胞中,COX-2的水平.
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Sp1/Kruppel样转录因子家族研究进展
Spl/Kruppel样转录因子(Spl-like and Kruppel-like transcription factors,Spl/KLFs)是参与真核细胞转录的高度相关锌指蛋白,以细胞和启动子特异性方式通过调控富含GC启动子的基因表达,参与调节细胞功能如细胞增生、凋亡、分化和肿瘤形成.
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p63基因研究进展
p63是近年发现的p53家族成员之一,由于启动子的不同和3'端剪切方式的不同,p63基因可编码多种具有不同活性的异构体,可分成两大类:具有反式激活区的TA异构体和N末端截短的△N异构体.TA异构体具有p53样活性诱导细胞周期停滞和凋亡,△N异构体则抑制p53的功能促进转化细胞的生长.p63主要在各种上皮组织的发育、分化和形态发生上起重要作用,对于胚胎形成过程中外胚层的发育具有重要的意义,在肿瘤发生中更多的是致癌作用而不是抑癌作用.
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复方甘草甜素下调细胞周期素依赖性激酶1启动子表达
目的:了解复方甘草甜素调节细胞周期素依赖性激酶1(CDK1)基因启动子的活性,为甘草甜素的作用机制提供理论依据.方法:以我室构建的细胞周期素依赖性激酶1启动子报告基因表达载体pCAT3-CDK1-P瞬时转染HepG2细胞,并用复方甘草甜素刺激,同时以转染pCAT3 basic的HepG2细胞为阴性对照,复方甘草甜素刺激后24 h后收获细胞.用酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞中氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性.结果:质粒pCAT3-CDK1-P在HepG2细胞中能够激活CAT的表达,而用复方甘草甜素刺激后抑制HepG2细胞中CAT的表达.pCAT3-CDK1-P转染HepG2细胞中,CAT表达活性是pCAT3-basic空载体的12.4倍,是甘草甜素刺激转染pCAT3-CDK1-P的HepG2细胞的9.3倍.结论:复方甘草甜素可以下调CDK1基因启动子的活性,进而下调CDK1基因的表达,为深入了解甘草甜素在肝纤维化和肝癌中的作用机制提供新的分子生物学依据.
关键词： 甘草甜素 细胞周期素依赖性激酶1 启动子 -
DAB2IP启动子荧光素酶报告基因载体的构建及其应用
目的 构建并鉴定DAB2IP启动子荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic-DAB2IP-luc,观察Snail在胃癌细胞中对DAB2IP表达调控.方法 利用PCR法克隆出DAB2IP启动子序列(1000bp),构建pGL3-Basic-DAB2IP-luc载体并酶切并测序鉴定.检测转染pEGFP-C1-Snail载体对pGL3-Basic-DAB2IP-luc双荧光素酶活性及对DAB2IP的表达水平的影响.结果 荧光素酶报告系统结果显示Snail+pGL3-Basic-DAB2IP-luc组荧光活性明显低于pGL3-Basic-DAB2IP-luc组和空白组(P＜0.01;P＜0.01),此外,pGL3-Basic-DAB2IP-luc组比空白组的荧光活性更低(P＜0.01;P＜0.01).荧光定量PCR和Western blot结果显示,转染pEGFP-C1-Snail下调DAB2IP的mRNA和蛋白水平.结论 转录因子Snail抑制DAB2IP的转录和表达.具有生物活性的pGL3-Basic-DAB2IP-luc的构建成功为研究DAB2IP在胃癌中转录调控机制提供了重要的研究工具.
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肝癌细胞中OY-TES-1基因启动子的甲基化状态
目的:研究肝癌细胞株OY-TES-1启动子的甲基化状态及甲基转移酶抑制剂对其启动子甲基化的影响.方法:运用生物信息学在线软件预测OY-TES-1启动子区域及转录因子结合位点；应用亚硫酸氢盐测序法(bisulfite-sequencing PCR,BSP)分析目的基因CpG位点的甲基化状态；用甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR干预肝癌细胞株BEL-7404,比较干预前后OY-TES-1启动子甲基化状态的改变,结果:通过软件分析确定了OY-TES-1启动子区域位于-184-+67 bp,该区域含多个潜在的转录因子结合位点；在6种肝癌细胞株中OY-TES-1启动子的甲基化频率范围为51.25％-87.92％;肝癌细胞株BEL-7404经过5-Aza-CdR干预后,甲基化频率由干预前的87.08％下降至21.25％.结论:在检测的肝癌细胞株中,OY-TES-1启动子呈高甲基化状态,甲基转移酶抑制剂能显著降低肝癌细胞株OY-TES-1启动子甲基化频率.
