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食品中多重耐药大肠埃希菌携带产超广谱β内酰胺酶可转移质粒的特征研究
目的 研究食品中分离的多重耐药大肠埃希菌携带ESBLs可转移质粒分子特征.方法 465株大肠埃希菌株来自2013—2014年全国污染物监测网食源性致病菌(凉拌菜,n=159;生肉,n=102;预制肉制品,n=95;蛋糕米面,n=46;热菜,n=63).采用Mueller-Hinton琼脂平板进行ESBLs筛选后,使用琼脂稀释法对菌株进行耐药性检测;采用PCR和序列分析对ESBLs菌株进行基因、质粒分型研究;采用S1-PFGE法分析菌株携带质粒的特征;运用肉汤接合实验确定编码ESBLs基因质粒的可移动性.结果 465株大肠埃希菌株中有12株对头孢噻肟耐药,并且均为产ESBLs菌株.12株头孢噻肟耐药菌株均携带CTX-M型耐药基因,其中7株还同时携带TEM型.通过S1-PFGE的分析,12株头孢噻肟耐药菌株中,每株菌至少携带了1个质粒,多携带有4个质粒,质粒大小范围为47~220 kb.共有7株菌可以将携带CTX-M质粒转移到受体菌株J53,且每个成功发生转移的供体菌仅转移1个质粒.结论 食品中多重耐药菌株及ESBLs基因型别均具有多样性;ESBLs耐药基因质粒的可转移性威胁我国食品安全.
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临床分离阴沟肠杆菌耐药性水平传播研究
目的 探讨昆明三级甲等综合医院临床分离阴沟肠杆菌的耐药性及其水平传播机制.方法 采用美国临床实验室标准化研究所(CLSI)推荐的K-B法药敏试验检测昆明市第一人民医院2002年7月至2004年6月临床分离阴沟肠杆菌对临床常用23种抗生素的耐药性;用接合试验分析多重耐药性的水平传播状况.结果 103株临床分离到的阴沟肠杆菌对23种常用抗生素的药物敏感试验显示:广谱青霉素类,第一、第二代头孢菌素的耐药率在80%以上;三代头孢菌素除头孢他啶外,耐药率均大于70%;头孢吡肟的耐药率为31.5%;头酶素类的耐药率65%以上;亚胺培南100%敏感;广谱青霉素与β-内酰胺酶抑制剂复合制剂耐药率为50%～90%;氨基糖甙类中庆大霉素耐药率高迭66.7%.而阿米卡星耐药率不高,只有14.1%;喹诺酮类的环丙沙星耐药率为48.4%;磺胺类的复方新诺明耐药率为64.8%.对52株耐第三代头孢菌素菌株的接合试验显示,23.1%菌株的的耐药性可通过接合传递.结论 该院临床分离阴沟肠杆菌的多重耐药严重,部分菌株的耐药性可在不同种菌株间水平传递.
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耐药铜绿假单胞菌携带的整合子及其耐药基因盒检测分析
整合子系统是铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)产生耐药的重要因素,其包括5'保守序列(CS,包括整合酶基因int、重组位点att Ⅰ和1个启动子)和3'CS(由qacE△1和sul1组成);整合子携带的耐药基因盒包括1个单独的基因和1个下游的重组位点attC;整合子通过att Ⅰ和attC位点之间或2个attC位点之间的重组而捕获耐药基因.本研究对临床分离的13株耐药PA菌行药物敏感试验后,对整合子和基因盒的携带情况进行检测,并对序列、定位及质粒接合试验进行分析.
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耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌耐药机制研究
目的：研究临床分离的耐亚胺培南肺炎克雷伯菌的分子流行病学及耐药机制，为制定预防控制该类细菌传播提供系统的试验数据和参考依据。方法收集并鉴定碳青霉烯类抗菌药物耐药肺炎克雷伯菌40株，肠杆菌基因间重复性一致性序列‐PCR（ERIC‐PCR）分析菌株的分子流行病学；药敏试验采用琼脂稀释法，改良Hodge方法检测碳青霉烯酶，EDTA‐Na2双纸片协同法检测金属β‐内酰胺酶，PCR及耐药基因克隆测序方法研究细菌的耐药机制，质粒结合试验确定耐药基因的转移性。结果40株肺炎克雷伯菌仅对多黏菌素和替加环素显示了较好的敏感性；改良Hodge试验阳性30株，金属酶检测试验结果均为阴性；ERIC‐PCR将40株肺炎克雷伯菌分为4型，以Ⅰ型为主；PCR结果显示，KPC‐2型32株、CTX‐M‐9型27株、SHV型22株、TEM型19株，其中有25株同时携带≥3种的耐药基因；质粒接合试验显示，3株分离菌株成功传递了对碳青霉烯类的耐药性。结论医院存在质粒介导的碳青霉烯类耐药性的水平传播；耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌耐药机制主要是产KPC‐2碳青霉烯酶，CTX‐M‐9、SHV和TEM型β‐内酰胺酶同时参与其多药耐药机制。
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鲍曼不动杆菌对氨基糖苷类药物耐药机制研究
目的 研究对氨基糖苷类抗菌药物耐药的鲍曼不动杆菌分子流行病学特征和耐药机制.方法 采用琼脂稀释法检测抗菌药物对鲍曼不动杆菌的低抑菌浓度(MIC),采用肠杆菌科基因间重复一致性序列(ERIC)-聚合酶链反应(PCR)研究耐药菌株的分子流行病学特征,采用特异性PCR、序列分析和接合试验研究介导耐药的分子机制.结果 临床分离菌株对包括氨基糖苷类抗菌药物在内的多种药物广泛耐药,同源性分析显示属于7个流行克隆型.所有分离菌株均扩增出介导氨基糖苷类抗菌药物耐药的修饰酶和药物"外排泵"基因,部分菌株扩增出甲基化酶基因.结论 修饰酶和甲基化酶介导鲍曼不动杆菌临床分离株对氨基糖苷类药物耐药,药物"外排泵"参与介导耐药机制形成,垂直传播和通过耐药性质粒的水平传递可能是耐药菌株播散的主要方式.
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4株产TEM型超广谱β内酰胺酶肠杆菌科细菌的研究
目的:鉴定临床分离的3株大肠埃希菌和1株肺炎克雷伯菌所产的TEM型β内酰胺酶编码基因的序列,并进行原核表达,了解其相关特性.方法:聚合酶链反应(PCR)扩增TEM型β内酰胺酶编码基因片段,克隆人pGEM-T easy载体,表达于感受态细胞大肠埃希菌DH5α中,双脱氧链终止法测定核苷酸序列,确定基因型;其基因与原核表达载体(pET-28c)连接,并在感受态细胞大肠埃希菌DH5α中进行原核表达,提取质粒,用PCR进行表达鉴定,用超广谱β内酰胺酶(ESBLs)表型确认试验鉴定表达菌株的表型,另外对这些临床菌株进行接合试验.结果:PCR扩增结果显示这4株细菌产生的TEM型β内酰胺酶编码基因片段含981个核苷酸,其表达酶的性质均为ESBLs,临床菌株的质粒接合试验均为阳性.这4株临床菌株所产生的TEM型β内酰胺酶的编码基因已被GenBank命名为TEM-10(GenBank注册号:U95363).结论:安徽地区这4株细菌所产TEM型β内酰胺酶均为TEM-10,在国内我们首次从临床分离株中发现TEM-10.
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TEM-105编码基因的功能研究
目的获得浙江地区临床分离的4株肺炎克雷伯菌所产的TEM型β-内酰胺酶编码基因的序列,鉴定其基因型,并了解其相关特性.方法 PCR扩增TEM型β-内酰胺酶编码基因片段,克隆入pGEM-T easy载体,表达于感受态细胞大肠埃希菌 DH5α中,双脱氧链终止法测定核苷酸序列,确定基因型;其基因与原核表达载体(pET-28 c)连接,并在感受态细胞大肠埃希菌DH5α中进行原核表达,提取质粒,用PCR进行表达鉴定,用等电聚焦电泳测定原核表达菌株中酶的等电点(pIs),用ESBLs表型确认试验鉴定表达菌株的表型,另外对这些临床菌株进行接合试验. 结果 PCR扩增结果显示这4株细菌产生的TEM型β-内酰胺酶编码基因片段含1 009个核苷酸,其表达酶的性质均为非ESBLs,pIs均为5.4,临床菌株的质粒接合试验均为阳性.这4株临床菌株所产生的TEM型β-内酰胺酶的编码基因已被GenBank命名为TEM-105(GenBank注册号:AF516720).结论浙江地区这4株细菌所产TEM型β-内酰胺酶均为TEM-105,在世界上我们首次从临床分离株中发现TEM-105.
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CTX-M型和CMY型耐药基因的检测与传播机制的探讨
目的 筛查广州医学院第一附属医院临床分离的80株革兰氏阴性杆菌的CTX-M型或CMY型耐药基因,检测含CTX-M型或CMY型菌株的耐药情况以及初步探讨耐药传播机制中质粒介导耐药这一途径.方法 对该细菌进行总DNA的提取,PCR扩增该80株细菌的DNA.结合K-B法药物敏感试验,分析菌株的耐药特征,提取基因筛选为阳性的细菌,判定其质粒是否存在耐药基因,质粒接合试验判断是否为可接合质粒.结果 检出ESBLs产酶菌CTX-M型4株,占5%,AmpC产酶茵CMY型3株,占3.75%.对耐药基因的筛选为阳性的7株菌株质粒提取,有6株菌为阳性,质粒接合试验结果显示有2株菌的质粒为可接合质粒,野生茵和接合茵的质粒中均存在耐药基因.结论 CTX-M和CMY菌株呈现多重性耐药性,CTX-M和CMY菌株的耐药基因大部分位于质粒上,其中2株为可接合质粒,这一初步探讨为耐药传播机制的研究打下基础.
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质粒介导的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌耐喹诺酮类药物的研究
目的 研究质粒介导的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的流行情况及其对喹诺酮类药物耐药的作用.方法 采用聚合酶链反应(PCR)对大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的qnr基因进行筛选,用实验证明qnr基因可以通过质粒介导并在细菌之间传递.结果 在145株大肠埃希菌和125株肺炎克雷伯菌中共检出16株细菌携带qnr基因,其中12株为大肠埃希菌,4株肺炎克雷伯菌.16株qnr基因阳性菌株均为产超广谱内酰胺酶(ESBLs)菌株且呈多重耐药性.结论 共检出16株细菌携带qnr基因,其阳性率为5.9%,大肠埃希菌阳性率高于肺炎克雷伯菌.qnr基因可以通过质粒介导,从供体菌接合转移至受体菌,且qnr在接合子中较稳定.
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1株阴沟肠杆菌临床分离株对亚胺培南耐药机制的研究
目的：探讨阴沟肠杆菌临床分离株对亚胺培南的耐药机制。方法采用微量肉汤稀释法测定低抑菌浓度（M IC ）值，用改良Hodge试验检测碳青霉烯酶；PCR扩增检测碳青霉烯酶（blaKPC、blaIMP‐1、blaIMP‐2、blaVIM‐1、blaVIM‐2）编码基因和广谱及超广谱β‐内酰胺酶（blaTEM、blaSHV、blaCTX‐M‐1、blaCTX‐M‐2、blaCTX‐M‐9）编码基因；耐药基因水平传播采用质粒结合试验。结果阴沟肠杆菌临床分离株除对阿米卡星、环丙沙星、加替沙星、左氧氟沙星敏感及妥布霉素中介外，对所有β‐内酰胺类抗菌药物、庆大霉素、四环素、甲氧苄啶／磺胺甲恶唑等抗菌药物均耐药。改良 Hodge试验为阳性。PCR扩增5种碳青霉烯酶基因和5种广谱及超广谱β‐内酰胺酶基因，显示blaT EM基因扩增阳性，其余基因扩增阴性。质粒接合试验成功传递了对碳青霉烯类抗菌药物的耐药性，接合子菌株相较于阴沟肠杆菌临床株，呈现出低水平耐药。结论此分离株产碳青霉稀酶，携带T EM基因，并可以经质粒转导播散。
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多重耐药鲍曼不动杆菌质粒上Ⅰ类整合子基因的研究
目的 检测鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)质粒上Ⅰ类整合子基因情况,以探讨质粒上Ⅰ类整合子与鲍曼不动杆菌耐药性的关系.方法 对71株MDR鲍曼不动杆菌用VITEK分析仪进行药敏分析,通过PCR检测质粒上Ⅰ类整合酶基因及Ⅰ类整合子的可变区并进行测序.同时我们通过质粒的接合试验探索整合子基因是否会通过质粒进行传递.结果 71株鲍曼不动杆菌均表现为多重耐药,其中有67株(94.4％)检测出Ⅰ类整合子系统,Ⅰ类整合子阳性菌株中,44(65.7％)株细菌携带基因盒,且主要呈现3种大小,分别为3074、2600和1700bp.整合子可通过质粒的接合试验传递给受体菌并稳定传代.结论 Ⅰ类整合子在多重耐药鲍曼不动杆菌质粒上广泛存在,可变区可捕获不同基因呈多种类型,且可通过质粒水平传播,与鲍曼不动杆菌多重耐药性之间有密切的关系.
