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细胞色素酶CYP2C19介导的沙利度胺体外抗血管生成作用研究
本研究探讨人肝细胞微粒体代谢系统对治疗多发性骨髓瘤的沙利度胺体外抗血管生成的影响及细胞色素酶CYP2C19在其中的作用.采用沙利度胺原药或与人肝细胞微粒体在体外共孵育后用MTT法检测人脐带静脉内皮细胞(human umbilical cord vein endothelial cells,hUCVEC)增殖活力,用流式细胞术测定hUVCEC细胞周期和细胞凋亡,以改良的Boyden小室法检测hUCVEC细胞迁移力,以体外小管形成实验检测hUCVEC分化.结果表明:沙利度胺原药对hUCVEC活力无明显抑制作用,细胞凋亡比例也无明显增加,轻度影响细胞迁移,无抗小管形成作用;当与人肝细胞微粒体共孵育后hUCVEC增殖活力明显受抑.100μg/ml沙利度胺与肝细胞微粒体共孵育后hUCVEC增殖活力的抑制率达(11.7±3.9)%,凋亡细胞增加达27.2%,明显下调细胞迁移力并抑制体外小管形成.在共孵育体系中加入CYP2C19特异性抑制剂奥美拉唑,可减弱沙利度胺抑制hUCVEC增殖活力和诱导凋亡的作用,减低细胞迁移力和部分逆转抗小管形成的作用.结论:沙利度胺的体外抗血管生成作用依赖于人细胞微粒体的作用,细胞色素酶系中的CYP2C19可能参与了这一过程.
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血管内皮细胞的活化或损伤诱导平滑肌细胞的增生和凋亡
一、材料与方法1.细胞培养:采用改进的Jaffe氏培养法,培养人脐带静脉内皮细胞.采用贴块法培养人脐动脉平滑肌细胞并传代.培养液均为含20%胎牛血清的DMEM培养液.
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线粒体生物合成的改变对高糖诱导的活性氧类生成的影响
目的 探讨过氧化物酶体增殖激活受体γ辅助激活因子1α(PGC-1α)对血管内皮细胞内线粒体生物合成的影响,明确线粒体的生物合成对葡萄糖诱导的活性氧类(ROS)生成的影响.方法 将原代培养的人脐带静脉内皮细胞(HUVECs)及小牛主动脉内皮细胞(BAECs)分成四大组,并分别将四组细胞模拟人体正常糖及高糖环境,浓度为5、30 mmol/L进行培养,测量细胞内ROS浓度.结果 对BAECs和HUVECs分别进行协方差分析结果显示,在两种细胞中,不同组别之间差异均有统计学意义(P＜0.01),不同糖水平对ROS浓度有影响(P＜0.05)；对BAECs单独进行分析发现,PGC-1α抑制表达组的ROS浓度在正常糖水平下显著低于对照组及空质粒组(P＜0.01),高糖水平下也低于对照组及空质粒组(P＜0.05)；PGC-1α过度表达组的ROS浓度正常糖水平显著高于对照组(P＜0.01),与空质粒组相比差异无统计学意义(P＞0.05)；对HUVECs分析发现,PGC-1α抑制表达组ROS浓度在正常糖水平和高糖水平下均低于空病毒Ad组和对照组(P＜0.01)；PGC-1α siRNA转染组的ROS浓度正常糖水平显著高于对照组(P＜0.Ol),与空质粒组差异无统计学意义(P＞0.05).结论 高糖组较正常糖组血管内皮细胞产生更多ROS,过度表达PGC-1α后,细胞内ROS浓度显著降低；反之,ROS浓度显著升高.
关键词： 活性氧簇线粒体 小牛胸主动脉内皮细胞 人脐带静脉内皮细胞 高糖 -
纳米羟基磷灰石人工心脏机械瓣膜对细胞毒性评价
目的 用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测羟基磷灰石(HA)对人脐带内皮细胞可能存在的细胞毒性.方法 用MTT比色方法评价材料的细胞毒性.设常温浸提液组和高温浸提液组.两组均设置各自对应的阳性和阴性对照组.将加入浸提液和材料并培养72 h后的各组样品分别在倒置相差显微镜下观察细胞在浸提液中及在材料边缘的形态变化及生长状况,以细胞毒性实验来评价生物材料生物相容性.参照国际标准化组织(ISO)制定的细胞毒性实验的标准,即ISP10993-5:1992<医疗器械生物学评价细胞毒性实验体外法>之评价标准和要求.结果 材料浸提液与细胞共培养组24 h时观察常温浸提液、高温浸提液及阴性对照组的HUVEC细胞形态、数量,各实验组与阴性对照组差异无统计学意义.结论 HA材料对人脐带内皮细胞生长抑制反应级别为1级或0级,无明显毒性作用,有良好的细胞相容性.
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烟曲霉素抑制小鼠结直肠癌生长及转移的体内外研究
背景与目的:血管新生与肿瘤生长密切相关,烟曲霉素(Fumagillin)可特异性抑制血管内皮细胞的增殖,但其对结直肠癌的治疗作用尚不十分清楚.本研究旨在探讨Fumagillin对结直肠癌细胞系生长的抑制作用及其作用机制.方法:将WiDr或HT-29细胞以5×10~5几的量分别接种于20只SCID小鼠背部皮下,接种4周后每2日腹腔注射Fumagillin(0.1 mg/kg)或Cyclo(1 mg/kg)(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val)持续4周,然后处死动物并测量原发瘤质量及原发瘤内微血管密度.在体外培养脐带静脉内皮细胞(HUVECs),向培养基内加入Fumagillin(0.01 mg/kg)或Cyclo(0.1 mg/kg),观察其对HUVECs增殖及微管形成的抑制作用.以基因芯片技术筛选Fumagillin处理后HUVECs的基因表达变化,并以定量PCR和免疫印迹技术对基因芯片的结果做进一步验证.结果:Fumagillin处理组小鼠的结直肠癌原发瘤质量及肿瘤内CD105阳性的微血管数量显著小于对照组小鼠(P<0.05),体外实验显示,Fumagillin处理后HUVECs的增殖和微管形成受到明显抑制,基因芯片检测显示Fumagillin处理后HUVECs有71个基因表达上调和143个基因表达下调,表达变化的基因多与细胞黏附、移动、增殖和基因转录有关.定量PCR和免疫印迹技术发现Fumagillin抑制HUVECs表达cyclinE2,白细胞活化黏附因子(activated leukocyte cell adhesion molecule,ALCAM)和细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1).结论:Fumagillin通过抑制新生血管的形成来抑制结直肠癌的生长.
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睾酮诱导人脐带静脉内皮细胞ERK1/2磷酸化的研究
目的:观察生理浓度睾酮(3×10-8mol/L)对人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)细胞外信号调节激酶ERK1/2磷酸化水平的影响. 方法:将体外培养的HUVEC分为5个时间段睾酮组(睾酮作用后0、5、15、30、60 min)和雄激素受体拮抗剂氟他胺预处理组,Western印迹测定睾酮作用于HUVEC后ERK1/2的活化程度. 结果:睾酮可激活HUVEC ERK1/2,30 min后达到高峰,而雄激素受体拮抗剂氟他胺可抑制睾酮对ERK1/2的激活. 结论:生理浓度睾酮可通过雄激素受体促进细胞外信号调节激酶ERK1/2磷酸化,且在作用30 min后达到大效应.
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胶原酶脐带灌注消化法在人脐带静脉内皮细胞的原代分离培养中的作用
目的 探讨人脐带静脉内皮细胞原代分离培养方法,为血管内皮功能及其相关疾病的研究奠定基础.方法 采用0.1%Ⅰ型胶原酶脐带静脉灌注消化法,分离得到血管内皮细胞后,加入M199混合培养液,置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养,以0.25%胰蛋白酶进行消化传代培养.细胞鉴定采用形态学方法、透射电镜法以及细胞Ⅷ因子免疫化学法.结果 原代人脐静脉内皮细胞约24 h后完全贴壁,第3～4天融合成单层,呈铺路石状镶嵌排列;细胞透射电镜观察可见特征性Weibel-Palade小体以及细胞表面大量微绒毛;细胞Ⅷ因子抗原免疫组化以及荧光显示均呈阳性反应,证实所分离培养细胞为人脐带静脉内皮细胞.结论 采用胶原酶脐带静脉灌注消化法可分离得到较为纯化的内皮细胞,并可在体外连续大量增殖传代,5代内的细胞均可用于研究.
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穿心莲内酯抑制肿瘤细胞分泌物诱导的血管新生
目的:探讨穿心莲内酯(andrographolide,Andro)对人脐带静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)成管能力的影响.方法:将不同体积浓度的Andro溶液作用于HUVECs,采用细胞计数试剂盒-8(Cel Counting Kit-8,CCK-8)检测细胞存活率.采用半数致死量(IC50)的Andro溶液作用于HUVECs,采用Matrigel胶使HUVECs成管,通过计算成管率来评估Andro溶液对HUVECs成管能力的影响.此外,将A549细胞分泌物与Andro溶液同时处理HUVECs,检测其成管情况.采用Western印迹检测Andro溶液对基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)表达水平的影响.结果:Andro溶液可抑制HUVECs的增殖,且呈浓度依赖性;Andro溶液对HUVECs的IC50为20 μmol/L.选取20 μmol/L的Andro溶液作用于HUVECs 24 h,发现Andro溶液显著抑制HUVECs的成管能力.另外,A549细胞分泌物促进HUVECs成管作用,而Andro溶液拮抗肿瘤细胞分泌物对HUVECs成管的促进作用,降低MMP-9的表达.结论:Andro能够抑制HUVECs成管,而且能够拮抗肿瘤细胞分泌物对HUVECs成管的促进作用,从而抑制血管新生.
