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乳鼠肌源干细胞的培养及其成肌分化的实验研究
目的 体外培养乳鼠肌源干细胞,探讨其成肌分化的能力. 方法 采用混合酶消化法制备乳鼠肌源干细胞,反复差速贴壁法纯化,利用银环蛇毒素鉴定肌管表面的乙酰胆碱受体,并对相应的与肌分化相关的蛋白进行免疫荧光分析. 结果 体外培养的肌源干细胞分化成肌管,表达乙酰胆碱受体,且表达骨骼肌和心肌特异性蛋白. 结论 采用混合酶消化法消化,反复差速贴壁法纯化可以得到多数量高纯度的肌源干细胞.
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烟碱型乙酰胆碱受体与临床疾病
烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)是配体门控的离子通道受体家族成员,广泛分布于中枢神经、神经肌肉接头以及其他细胞表面.构成亚基不同和分布部位的差异表现为受体功能的多样性.早期研究发现,nAChR主要与神经电信号传导有关;近期研究认为它是胆碱能抗炎通路的关键受体.阐明这些功能的生理机制对重症肌无力、癫痫以及多器官衰竭等相关疾病有重要的临床意义.
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毒蕈碱型乙酰胆碱受体的鼻黏膜效应
副交感神经参与鼻黏膜腺体和血管的功能调节.当各种异物、细菌、病毒或真菌侵入机体时, 鼻黏膜微环境发生改变, 这种变化刺激副交感神经释放乙酰胆碱.后者与调节鼻腺体和血管的毒蕈碱型乙酰胆碱受体 (M-ChR) 结合,导致鼻炎流涕和鼻塞.这种整体调节反射对下呼吸道起重要的防御性保护作用. 目前发现五种M-ChR亚型(M1-至M5- ChR),鼻黏膜有M1-至 M3- ChR亚型.高密度的M1-和M3- ChR共存于黏膜下腺黏液和浆液细胞, M3-ChR主要分布于血管.M-ChR对鼻腺体和血管的直接调节作用是通过细胞内腺苷酸环化酶和磷酯酶C激活.
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中枢甘氨酸受体分子特性的研究
甘氨酸受体(GlyR)介导的抑制性神经传递在哺乳动物中枢神经系统(CNS)反射活动、随意运动调节和感觉信号的处理中具有重要作用[1].GlyR五聚体由三个独立的多肽组成:两个糖蛋白(48 kD和58 kD),分别称为α和β亚单位,另一个为93 kD的细胞质蛋白,叫"gephyrin".GlyR与尼古丁型乙酰胆碱受体(nAChR)、GABAA受体(GABAAR)、5-HT3受体(5-HT3R)等具有很大的同源性.它们一起形成一个配体门控离子通道(LGICs)超家族.LGICs的五个跨膜亚单位形成离子通道孔区.就GlyR而言,该离子通道选择性地通透Cl-.
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消除疼痛的终理想还有多远——一种离子通道病显示出疼痛的根源
医学的分类一向是以器官为基础,例如心脏病、胃病、甲状腺病.到了分子医学时代,常常以某一种分子或基因的异常作为疾病分类的基础,例如受体病(以乙酰胆碱受体自体免疫引起重症肌无力症、自身免疫性甲状腺病为例)、离子通道病(以钠离子通道突变引起伴有高热惊厥的癫痫、高钾性阵发性瘫痪为例)等等.这种分类有可能导致医学变革的新局面,目前仅仅是拉开了序幕.本文将介绍的是发生在中国的科学故事:一种皮肤病的研究,如何开启了寻找理想镇痛药的大门.
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人乙酰胆碱受体α-亚基在大肠杆菌中的表达
目的 通过将乙酰胆碱受体(AchR) α-亚基与分子伴侣蛋白(Chaperonin)共表达,减少包涵体含量,提高可溶性目的蛋白含量.方法 将乙酰胆碱受体α-亚基结构域基因的重组质粒pPR506与含分子伴侣蛋白GroESL基因的重组质粒pGE60一起转入E.coli DH5α,并在IPTG诱导下共表达.结果 由于分子伴侣蛋白具有协助重组蛋白再折叠的功能,其共表达产物与仅含pPR506的工程菌单一表达产物相比,前者增加了以非包涵体形式的表达.产物经SDS-PAGE、免疫印迹试验与FPLC分离等分析,均表明该工程菌的共表达产物为AchR α-亚基结构域(相对分子质量为13×103)及其与GroES的络合物(23×103).结论 分子伴侣蛋白帮助了重组蛋白在菌体内的正确折叠,提高了目的蛋白的可溶性.
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人免疫球蛋白转基因小鼠自身免疫性重症肌无力模型的建立
重症肌无力(myasthenia gravis,MG)是由乙酰胆碱受体(acetylcholine receptor,AchR) 抗体介导的自身免疫病.AchR抗体与神经肌肉接头处的AchR结合,通过抗原调变、激活补体导致突触后膜裂解而使AchR数量减少,结果出现肌肉收缩无力等症状.MG的动物模型--实验性自身免疫性MG(experimental autoimmune MG,EAMG)可经主动免疫动物富含AchR的电鳐(Torpedo)电器官制备的AchR(tAchR)诱导出.
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重症肌无力致病性自身抗体的人工构建
目的 构建一株具有致病性的人抗乙酰胆碱受体(AchR)自身抗体,用于诱导猴实验性自身免疫性重症肌无力(EAMG)模型.方法 将分离自重症肌无力(MG)患者胸腺的抗AchR抗体的抗原结合片段(Fab637)克隆至含有免疫球蛋白(IgG1)基因的载体pIgG1,构建能在哺乳类细胞表达完整IgG1类抗AchR抗体(IgG1-637)的重组表达载体(pIgG1-637),将pIgG1-637转染CHO-k1细胞系,筛选出稳定表达IgG1-637的细胞株扩大培养.将纯化的IgG1-637注射5只恒河猴,通过检查猴肌肉收缩强度和复合肌肉运动电位(CMAP),判定猴EAMG发病情况,从而鉴定IgG1-637的致病性.结果 20 μmol/L MSX(L-methionine sulfoxmine)选择的CHO-k1细胞表达高水平的抗体IgG1-637,表达产量为17.4μg/ml.3只猴(分别接受1.7、1.7和5.0 mg/kg的注射剂量)在注射IgG1-637后1周内出现肌肉收缩无力临床症状,并表现出CMAP减弱现象.结论 由Fab637构建的完整的IgG1-637是一株致病性抗AchR抗体,可在猴诱导出EAMG.
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免疫抑制剂治疗重症肌无力新进展
重症肌无力(MG)是以突触后肌终板处的乙酰胆碱受体被自身致敏和破坏为主要特征的一种自身免疫性疾病(autoimmune disease, AID),其中大部分患者体内存在有抗乙酰胆碱受体(AchR)抗体,同时尚有部分患者血清中无法检出AchR抗体,该类患者的发病则可能与一种特异性受体的酪氨酸激活酶(MuSK)[1]有关.McConville等[2]曾报道在41%的血清AchR抗体阴性的患者中检出MuSK.对于MG的治疗,现在的主要药物或方法有胆碱酯酶抑制剂、免疫抑制剂、胸腺切除术、血浆置换和静脉注射免疫球蛋白(IVIG)等,其中免疫抑制剂在治疗中起着重要的作用,随着药物研究的深入,更多的新型免疫抑制剂被成功地开发并投入临床试用.
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脓毒症时氯胺酮抗炎作用的研究进展
氯胺酮是苯环己哌啶衍生物,属 N-甲基-D-天门冬氨酸( NMDA)受体拮抗剂。1965年, Domino首次将其应用于临床,并且由于其镇痛效果确切,呼吸抑制轻微,循环轻度兴奋,为临床麻醉常用药物之一。近年来的研究发现,氯胺酮除了具有传统的麻醉作用外,对机体兼有生物活性作用,例如:抗炎,脑保护,解除支气管痉挛,超前镇痛等。尤其对机体严重创伤的患者,如失血性休克、感染性休克、脑外伤等,具有独特的保护作用[1]。但是,氯胺酮的抗炎及其他生物学活性的作用机制目前尚不十分确切,可能涉及NMDA受体、单胺类受体、阿片类受体、乙酰胆碱受体和电压门控通道等[2]。
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成人型Ⅱ型糖原累积症一例
患者女,36岁,因胸闷心悸7月余,加重伴双下肢乏力、水肿10 d于2010年入院。7个月前于劳累后出现胸闷、心悸症状,自觉心跳加快,无胸痛,无头痛头晕,无黑矇晕厥,无大汗淋漓,持续数分钟,休息后可缓解,未予重视。后每于劳累后反复出现上述症状。2个月前上述症状加重,持续时间明显延长,家人诉其睡眠时口唇及指甲紫绀明显,仍未就诊。10 d前患者再次出现胸闷、心悸,伴夜间阵发性呼吸困难,双下肢乏力、中度凹陷性水肿,来我院就诊。入院查体:神志清楚,语音低微,双眼睑下垂,呼吸力弱,口唇及指端发绀,心肺腹查体未见明显异常;双上肢近端肌力5级,远端肌力5-级,双下肢近端肌力3级,远端肌力2级,骨盆带及双下肢肌肉轻度萎缩,四肢肌张力降低,腱反射消失,病理征阴性。辅助检查:血常规、C反应蛋白、红细胞沉降率、IgE、肾功能电解质、肌酸激酶(CK)、CK-MB、肌钙蛋白I、抗核抗体全套、抗sDNA、抗中性粒细胞抗体全套均无明显异常。头颅CT未见明显异常。胸部X线片:(1)两肺纹理增多增粗、模糊;(2)右上肺肺不张可能;炎症待排;(3)右侧胸膜反应。肌电图:(1)未见周围神经损害;(2)可疑肌源性损害;(3)重复电刺激见可疑递减现象。睡眠监测示:肺泡低通气综合征。超声心动图提示:中量心包积液。新斯的明试验阴性,乙酰胆碱受体抗体检测阴性。股四头肌肌肉病理活检:特殊染色及免疫组化:慢肌球蛋白重链(MHCs),肌球蛋白快速重链(MHCf),还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶-四氮唑还原酶染色(NADH-TR),三磷酸腺苷酶染色(ATPase pH9.4),细胞色素氧化酶染色(COX),细胞色素氧化酶/琥珀酸脱氢酶染色(COX/SDH),琥珀酸脱氢酶染色(SDH)均(-),肌肉分型好,Ⅰ、Ⅱ型纤维内均见嗜碱性物质沉积,PAS染色阳性,经过唾液淀粉酶消化后消失[PASD(-)],未见明确坏死再生纤维[MHCd(-),MHCn0(-)],未见明确破碎红细胞,细胞间脂滴油红O(+),考虑Ⅱ型糖原累积病可能性大(图1,2)。
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胰岛素治疗对糖尿病大鼠膀胱M2、M3乙酰胆碱受体mRNA表达的影响
目的 检测链脲佐菌素诱导的DM大鼠模型膀胱乙酰胆碱受体mRNA表达水平的变化及胰岛素治疗的影响. 方法 实验大鼠分为正常对照组(NC组)、DM模型组(DM组)和胰岛素治疗组(DM+Ins组).成模10周后取膀胱提取RNA, RT-PCR半定量分析3组大鼠膀胱乙酰胆碱M2和M3受体mRNA. 结果 与NC组相比,DM组和DM+Ins组M2受体mRNA表达上调显著并以DM组多,差异有统计学意义(P<0.01).DM组和DM+Ins组M3受体mRNA表达下调较NC组显著(P<0.01),尤以DM组明显(与DM+Ins组比较,P<0.05). 结论 DM大鼠膀胱M2受体mRNA表达增加,M3受体mRNA表达则减少,胰岛素治疗可能预防或减轻上述变化.
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烟碱样乙酰胆碱受体α7在支气管哮喘患儿外周血CD4+T淋巴细胞中的表达
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危重型重症肌无力患者腔镜下胸腺切除的围术期麻醉处理(附1例报告)
重症肌无力是一种获得性自身免疫性疾病,神经接头处乙酰胆碱受体受到破坏而引起患者肌肉收缩无力,容易出现乏力症状.其病情严重程度按Osserman[1]分期为:Ⅰ,仅累及眼肌;ⅡA,全身轻微肌无力,ⅡB,全身轻微肌无力和(或)球部肌肉功能异常;Ⅲ,急性进展和呼吸困难表现;Ⅳ,晚期全身无力.
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心脏瓣膜病合并重症肌无力的外科治疗
重症肌无力(myasthenia gravis,MG)是一种累及神经肌肉接头乙酰胆碱受体的自身免疫性疾病.1998年至2007年,我们对7例心脏瓣膜病合并MG病人行心脏瓣膜置换手术,现总结报道如下.
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胸腺瘤并发重症肌无力患者免疫调节因子的表达
目的 探讨胸腺瘤合并重症肌无力(myasthenia gravis,MG)患者肿瘤组织及血液中Aire、Foxp3、AchR及血液相关免疫学因子的表达及其在胸腺瘤伴发MG发病中的重要意义.方法 分别采用RT-PCR及SP免疫组化方法检测胸腺瘤伴发MG胸腺瘤组织中Aire、Foxp3、AchR mRNA及蛋白的表达,比较外周血T细胞亚群及免疫球蛋白等免疫学指标并结合临床特征进行统计学分析.结果 Aire、Foxp3、AchR mRNA及蛋白在合并重症肌无力患者胸腺瘤组织中表达降低,在Ossermann分型、病理类型、Masaoka分期之间差别有统计学意义(P<0.05),CD4 +/CDs+T细胞比值在胸腺瘤合并重症肌无力患者血清中增高(P<0.05).结论 Aire、Foxp3、AchR的异常表达在胸腺瘤伴发MG中发挥重要作用,CD4 +/CD8+T细胞比值、免疫球蛋白和补体C3的水平可作为评价胸腺瘤患者免疫状态的关键指标,具有重要的临床意义.
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重组表达人乙酰胆碱受体α1亚基胞外域蛋白
目的 获得大量正确折叠的重组人乙酰胆碱受体(AChR)αl亚基N末端胞外域(ECD)蛋白.方法 用RT-PCR方法从TE671细胞中扩增出AChR αl亚基全序列,在此基础上再扩增出ECD基因序列并将其插入到原核表达载体pET16b.以构建的新载体转化E.coli BL21(DE3)pLysS,培养物以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达并通过SDS-PAGE比较诱导前后蛋白表达情况.重组蛋白以Ni2+亲和层析纯化.蛋白透析复性后,以ELISA法检测活性.结果 PCR产物大小为650 bp,与预计相符;所构建质粒经测序证实ECD核苷酸序列正确,并正确插入载体pET16b.诱导所产生的大量包涵体蛋白经复性后正确折叠且具活性.结论 可通过原核表达获得大量正确折叠的可溶性重组人肌肉AChR al亚基ECD蛋白.
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伴肌萎缩重症肌无力4例分析并文献复习
目的 探讨伴肌萎缩重症肌无力(myasthenia gravis,MG)患者的临床特征、抗体及电生理特点,提高对此少见疾病的认识.方法 回顾性分析作者医院2003—2016年收治的伴肌萎缩M G患者4例的临床资料,分析其临床特征、抗体、神经电生理检查、治疗及预后特点.结果 4例患者病程中出现不同程度的肌肉萎缩,1例为手肌(左侧大鱼际肌、小鱼际肌及第一骨间肌)萎缩,3例为舌肌萎缩(其中1例同时伴面肌萎缩);抗体检查显示乙酰胆碱受体抗体(AChR-Ab)阳性3例,1例为抗骨骼肌特异性受体酪氨酸激酶抗体(MuSK-Ab)阳性.4例患者低频重复神经刺激波幅均可递减,高频刺激波幅未见明显递增.伴手肌萎缩MG患者针极肌电图检查结果提示神经源性损害.结论 伴肌肉萎缩MG较罕见,MuSK-Ab、AChR-Ab阳性MG患者均可出现肌肉萎缩,其机制有待进一步明确;早期行神经电生理检查、AChR-Ab及 MuSK-Ab测定有助于明确诊断.
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胸腺与重症肌无力
重症肌无力(MG)作为一种典型的自身免疫性疾病,其发病与患者胸腺内发生的异常免疫反应密切相关,大约80%左右的MG患者胸腺异常,包括胸腺增生、胸腺瘤等.因此,探索MG的发生、发展及其与胸腺内发生的免疫反应之间的关系,可为MG的治疗提供实验依据和新的思路.现就胸腺细胞及其表达的分子与MG的相关性做一综述.
关键词: 重症肌无力 胸腺 乙酰胆碱受体 自身免疫调节基因编码蛋白 T淋巴细胞 -
实验性自身免疫性重症肌无力大鼠CD28/CTLA-4:B7表达水平的研究
目的探讨实验性自身免疫性重症肌无力(EAMG)大鼠外周血单个核细胞(PBMC)CD28/CTLA-4:B7的表达水平. 方法健康、雌性Lewis大鼠24只,随机分为正常组、EAMG组、完全福(氏)佐剂(CFA)对照组.EAMG组大鼠分别于足垫、腹部及背部皮下多点注射丁(氏)双鳍电鳐电器官乙酰胆碱受体蛋白乳剂1 mL,第4周再次注射上述乳剂免疫大鼠.CFA对照组只接受等量的CFA皮下注射.初次免疫后7周分离PBMC,应用RT-PCR和流式细胞术分析方法,分别进行CD28、CTLA-4 mRNA及B7-1、B7-2蛋白表达水平检测. 结果 (1) 正常组大鼠PBMC CD28、CTLA-4 mRNA表达水平较低,尤其CTLA-4 mRNA仅有极少量表达;前二者在EAMG组大鼠表达水平均明显增加(P<0.001),而正常组和CFA对照组之间表达水平差异无显著性(P>0.05).(2) 正常大鼠B7-1、B7-2在PBMC上仅少量表达而EAMG组表达明显增加(P<0.001),正常组与CFA对照组比较差异均无显著性(P>0.05). 结论 EAMG大鼠存在PBMC CD28/CTLA-4:B7协同刺激分子的表达异常,CD28/CTLA-4:B7共刺激通路可能参与了机体异常免疫反应的诱导与维持,在重症肌无力(MG)的发生过程中发挥重要作用.
关键词: 重症肌无力 乙酰胆碱受体 协同刺激分子 CD28/CTLA-4:B7