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刺五加P450基因原核表达体系的建立与表达条件的优化
根据已克隆得到的刺五加P450基因的cDNA序列设计引物,构建刺五加P450基因的原核表达载体pET30a-P450,并对重组菌株BL21/pET30a-P450的原核表达条件进行了筛选优化.实验结果显示,pET30a-P450转化大肠杆菌BL21后可实现P450基因的原核表达,SDS-PAGE分析显示其在53 kDa处有显著诱导条带;表达体系的佳诱导温度为27～37℃,佳IPTG浓度为1 mmol·L-1,佳培养基为LB液体培养基,佳诱导时间为24h.因此,刺五加P450基因能够通过表达载体BL21/pET30a-P450实现该基因的原核表达,该体系的诱导温度、IPTG浓度、培养基种类以及诱导时间均可影响目的蛋白的表达量,但影响强度不同.
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SARS冠状病毒未知功能小蛋白大肠杆菌表达及条件优化
将人工合成的SARS-CoV三个未知功能小蛋白X4、X5和ORF10的编码基因克隆到载体pET32a中,构建其表达载体.再将这些表达载体转入大肠杆菌中进行表达,SDS-PAGE和Western blotting结果证明,X4、X5和ORF10三个基因在大肠杆菌中均获得表达.分别研究了温度、IPTG浓度、IPTG加入时间和诱导时间对重组蛋白表达的影响.通过正交分析,得到了上述三种重组蛋白的优化表达条件.根据佳条件表达重组蛋白,获得重组蛋白占总蛋白的百分比分别是:X4,20%;X5,27.8%;ORF10,68.5%.
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遗传病与相关表达条件——经络与遗传的关系
随着人类DNA基因谱的逐步被破译,发现很多疾病与遗传有关.甚至一些传染病象AIDS病都与遗传有关,现已发现有些人有抗AIDS病基因.
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家蝇抗真菌肽MAF-1原核表达条件优化及活性验证
目的 优化家蝇抗真菌肽(MAF-1)原核表达条件及重组蛋白的活性验证.方法 利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Quantity One凝胶电泳图像分析系统研究不同的诱导温度、异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导浓度和诱导时间对融合蛋白表达的影响;融合蛋白用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行蛋白纯化,切除His标签后进行活性验证.结果 在加入浓度为25 μmol/L的IPTG,34℃诱导18h,融合蛋白的表达量高;融合蛋白纯化后浓度为0.706 mg/mL,其低抑杀白色念珠菌的浓度为70 μg/mL.结论 成功获得重组融合蛋白的佳表达条件,并纯化目的蛋白,切除His标签后的目的蛋白具有抗真菌活性.
关键词： 家蝇抗真菌肽(MAF-1) 重组融合蛋白 表达条件 纯化 -
大肠杆菌表达系统中硒代半胱氨酸表达条件的优化
目的 在大肠杆菌中硒代半胱氨酸(Sec)表达需要四个基因产物,即selA,selB,selC和selD,通过调节这几个基因产物的量来优化Sec的表达条件.方法 根据前期已经构建的pBAD33-selAB和pEXT-selC载体,以包含β-半乳糖苷酶基因的Sec 表达载体(pN22)研究selAB以及selC的量对Sec表达量的影响,确定硒代半胱氨酸表达的佳条件.结果 共表达selAB、selC基因,Sec掺入效率提高了4.3倍,而传统方法表达pSUABC质粒的只提高了2.2倍.结论 本方法明显优于采用pSUABC质粒的方法,更有利于Sec的掺入,能促进硒蛋白的表达.
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重组人白细胞介素-31表达条件的优化
目的 优化重组人白细胞介素-31(rhIL-31)的表达条件.方法 以不同浓度IPTG、不同诱导时间、不同诱导温度对含有pET32a/rhIL-31的工程菌E. coli BL21(DE3)进行诱导表达,用SDS-PAGE对表达产物进行分析.结果 诱导时间为5 h,IPTG浓度为1.5 mmol/L,诱导温度为37℃时,rhIL-31的表达量高.结论 已初步优化了重组蛋白rhIL-31的表达条件.
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HBV PreS2-MBP融合蛋白在大肠杆菌中表达条件的优化
目的 优化HBV PreS2-MBP融合蛋白在大肠杆菌中的表达条件.方法 通过改变重组质粒的宿主菌、培养基、诱导温度、诱导剂、诱导剂浓度、诱导时间等条件,利用SDS-PAGE和BandScan凝胶分析软件,分析以上条件改变对表达产物表达量的影响.将重组质粒连续传100代,检测融合蛋白的表达稳定性.结果 重组质粒在大肠杆菌BL21菌株、GS培养基、28℃、0.5 mmol/L IFFG或1.5 mmol/L乳糖诱导4 h时,目的 蛋白的表达量高,占菌体总蛋白的43.5%.重组质粒传代100代,融合蛋白的表达稳定.结论 已确定出了融合蛋白在大肠杆菌中表达的佳条件.
关键词： HBV PreS2-MBP融合蛋白 大肠杆菌 表达条件 -
HIV-1 Gag蛋白酵母工程菌表达条件的优化
为了探索构建的表达HIV-1核心蛋白Gag酵母工程菌GS115/pPICGAG的佳表达条件,我们将该酵母工程菌分别在不同条件下进行诱导表达,通过ELISA检测培养上清中目的蛋白的表达量来分析佳表达条件,并分析了浓缩上清时适硫酸铵饱和度.
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重组人胸腺素α1融合蛋白在大肠杆菌中表达条件的优化
为提高人胸腺素α1(Tα1)融合蛋白在大肠杆菌中的表达量,研究了本实验室构建的pET39-Tα1重组质粒在E. coli BL21(DE3)宿主菌中的表达条件.经SDD-PAGE和凝胶成像系统GDS-8000分析结果表明,重组菌以LB为培养基,卡那霉素浓度为50 mg/L,开始诱导时的菌体密度为OD600=0.5,所加IPTG的浓度为0.5 mmo1/L,27.5℃摇床200r/min振荡诱导培养10 h时,可在周至空间中获得高效表达的可溶的Tα1融合蛋白,占周质蛋白总量的64.7%,为下一步纯化工作提供了方便.
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人肠生长激素工程菌高效表达培养工艺的研究
为了优化含有人肠生长激素(rh[Gly2]GLP-2)基因的融合表达工程菌pED-h[Gly2]GLP-2高效表达的适培养工艺条件,文章通过摇瓶培养研究了包括培养基组成、初始pH值、接种量、诱导剂,诱导剂浓度、诱导时机及诱导后培养时间等因素对蛋白表达量的影响,确定了该工程菌表达目的蛋白的佳条件,目的蛋白表达量可达40%以上,为基因工程产品的大规模工业化生产提供了一些有价值的数据.
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新型抗菌蛋白天蚕素-人溶菌酶在大肠杆菌中的表达条件优化及纯化
目的 探讨重组家蝇天蚕素-人溶菌酶( Mdc-hly)在大肠杆菌中的表达条件及纯化.方法 利用SDSPAGE电泳和BandScan凝胶电泳图像分析系统研究诱导温度、诱导时机、异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导浓度和诱导时间对融合蛋白表达的影响.融合蛋白经His琼脂糖柱素和色谱纯化后,Western blot鉴定.结果 在起始菌浓度为A600 =0.6时加入浓度为1.0 mmol/L的IPTG,37℃诱导6h,融合蛋白的表达量高,占菌体总蛋白的39.1％.纯化后融合蛋白纯度可达95％,Western blot鉴定为目的蛋白.结论 确定了重组融合蛋白的佳表达条件,并纯化了目的蛋白.
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胸腺素α1-胸腺五肽在大肠杆菌中的表达及表达条件优化
目的:探讨胸腺素α1-胸腺五肽(Tα1-TP5)在大肠杆茵中的表达及表达条件优化.方法:将化学合成的Tα1-TP5基因与原核表达栽体pGEX-4T-1融合并转化至E.coli BL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.利用SDS-PAGE电泳和AlphaEase凝胶电泳图像分析系统研究培养基组成、诱导时机、诱导温度、诱导剂浓度及诱导时间等条件对融合蛋白表达量的影响.融合蛋白经GST琼脂糖珠亲和色谱纯化及重组肠激酶切割后,电喷雾质谱鉴定Tα1-TP5.结果:选用TB培养基,在菌体对数生长中后期加入终浓度为0.05mmol/L的IPTG,37℃诱导5h,GST融合蛋白的表达量高,占菌体总蛋白的35.8%,且主要以可溶形式表迭.Tα1-TP5的分子质量与理论值相似.结论:Tα1-TP5成功在E.coli中表达,并确定了佳表达务件.
关键词： 胸腺素α1-胸腺五肽 胸腺融合肽 GST融合蛋白 大肠杆菌 表达条件 -
人PPARγ1LBD融合蛋白表达质粒的构建和诱导条件优化
目的 制备高纯度的人PPARγ1LBD融合蛋白,为筛选其配体奠定基础.方法 以人脂肪组织总RNA为模板,利用RT-PCR方法扩增出人PPARγ1LBD基因的cDNA片段,将其插入表达载体pMAL-p2X的麦芽糖结合蛋白(maltose binding protein,MBP)编码基因malE的下游,转化宿主菌E.coli.TB1.并对重组质粒在大肠杆菌TB1中的表达条件进行了优化.结果 经BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切,获得分子量为909bpDNA条带;当诱导剂IPTG浓度为0.4 mmol·L-1,30℃振荡诱导培养6 h时,重组菌TB1高效表达MBP-PPARγ1LBD融合蛋白,表达量可达胞质总蛋白的38.54%.结论 成功构建了能在TB1中高效表达人PPARγ1LBD融合蛋白的重组质粒,获得了具有高生物活性的融合蛋白.
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风疹病毒包膜糖蛋白E1的原核表达及条件优化
目的 为风疹病毒(RV)感染提供特异性及敏感性高的检测手段.方法 采用PCR扩增RV包膜糖蛋白E1基因202～353 aa片段,并将其插入表达载体pET30a(+),构建pET30a(+)-E1,转化BL21(plysS)菌株,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western Blot初步分析蛋白表达及抗原性;并探讨温度、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)浓度和诱导时间对目的 蛋白表达产量的影响.结果 获得相对分子质量约为16.6 kD的融合蛋白,Western Blot证明其具有良好的抗原性,并确定该蛋白在30 ℃、0.6 mmol/L IPTG的条件下诱导表达4 h可获得佳表达量.结论 本研究为RV包膜糖蛋白E1抗原纯化及应用奠定了基础,亦为研制生产高特异性和敏感性的RV检测试剂盒提供了实验依据.
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人自剪切TRAIL胞外段融合蛋白表达条件的优化
目的:在已构建肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL) 胞膜外段融合蛋白的原核表达载体基础上,进行表达条件优化,使其高表达为进一步研究其活性奠定基础.方法: 将前期构建的PCS/TRAIL 111-281原核表达载体转入大肠埃希菌BL21中,15% SDS-PAGE比较分析不同诱导剂浓度、诱导温度和诱导时间对融合蛋白表达量的影响.结果: 在诱导温度15℃,加入0.2 mmol/L 诱导剂(isopropy-β-D-thiogalactoside,IPTG)、诱导过夜时可以获得较高的可溶性融合蛋白表达量.结论: 诱导剂浓度、诱导温度、诱导时间对融合蛋白表达量有较大的影响.
关键词： 肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体 融合蛋白质类 表达条件 IPTG -
重组多价人精子表位肽的原核表达及其条件优化
目的 构建重组多价人精子表位肽原核表达质粒,优化其在大肠杆菌中的表达条件.方法 用化学合成法合成多价人精子表位肽基因.该基因经PCR扩增,BamHI和XhoI双酶切后,克隆至GST融合表达载体PGEX-4T-1获得重组质粒.将该重组质粒转化E.coli BL21 (DE3),经IPTG诱导表达.利用SDS-PAGE电泳和AlphaEase凝胶电泳图像分析系统,观察在摇瓶发酵条件下改变培养基组成、诱导温度、诱导时机、诱导剂浓度和诱导时间等条件对GST-多价人精子表位肽融合蛋白表达量的影响.结果 构建了重组多价人精子表位肽原核表达载体.在摇瓶实验中,优化的表达条件为:TB培养基,诱导温度37℃,在菌体对数生长的中后期进行诱导,IPTG诱导终浓度0.05 mmol/L,诱导时间5h.优化后GST-多价人精子表位肽融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的30.2％,且主要以可溶形式表达.结论 成功构建重组多价人精子表位肽原核表达质粒,重组表达载体在E.coli BL21 (DE3)内主要表达可溶形式的GST-多价人精子表位肽融合蛋白,在优化条件下可获得较高的表达量.
关键词： 重组多价人精子表位肽 GST融合蛋白 大肠杆菌 表达条件 -
重组福安泰-03融合蛋白表达条件的优化及其生物学活性检测
福安泰-03 (FAT-03)是从赤魟组织中分离得到,具有强抗血管生成活性的蛋白.本研究通过DNA重组技术获得了重组福安泰-03 (rFAT-03)融合蛋白,运用响应面试验设计法优化表达条件,采用GST亲和柱分离纯化表达蛋白,比较分析不同培养时间、诱导剂浓度、诱导温度和诱导时间对可溶性融合蛋白表达量的影响.结果表明,当培养时间为6.13h、诱导温度为19.71℃、诱导剂(IPTG)浓度为0.36 mmol/L、诱导时间为13.60 h条件下可获得较好的表达效果,可溶性目的蛋白GST-rFAT-03的得率为7.57 mg/L.对获得的rFAT-03生物活性检测显示,rFAT-03能明显抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管生成,且其效果与剂量相关.为后续对该蛋白的分离纯化和生物学功能研究奠定了基础.
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人PPARαLBD融合蛋白表达质粒的构建和诱导条件优化
过氧化物酶体增殖物活化受体α(Peroxisome prolifterator- activated receptor α,PPARα)属于Ⅱ型核受体,通过其配体结合区(1igand binding domain,LBD)结合特定的激动剂对参与机体代谢的关键酶、受体等的表达起调节作用.本研究以人肝组织总RNA为模板,利用RT-PCR方法扩增出人PPARαLBD基因的cDNA片段,将其插入表达载体pMAL-p2X的麦芽糖结合蛋白(Maltose binding protein,MBP)编码基因malE的下游,转化入宿主菌E. coli.TB1.然后对重组质粒在大肠杆菌TB1中的表达条件进行了优化.经SDS-PAGE分析和Bio-Rad Quantity One凝胶影像分析结果表明,诱导剂IPTG的浓度为0.4 mmol/L,30℃振荡诱导培养6 h时,可获得高效表达的MBP-PPARαLBD融合蛋白,重组蛋白的表达量可达胞质总蛋白的31.34%.为进一步纯化和PPARα配体筛选研究打下了良好的基础.
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rhTNF α表达条件的优化与中试发酵
为了确定出rhTNFα佳表达条件,实验利用正交试验设计方法,对rhTNFα工程菌的进行发酵培养和42℃热诱导,此后借助蛋白凝胶电泳分析软件对各组样品的凝胶电泳图片定量分析,利用方差分析对影响TNF基因工程菌对目的产物表达的几个重要的条件进行了优化,并终确定出pH7.5、培养温度27℃、培养时间4.5 h、诱导时间5 h的佳表达条件.在该条件下进行中试发酵TNF的表达产物占到了菌体总蛋白的60%左右,且大部分以可溶形式存在.说明在大肠杆菌生长正常的前提下适度低温培养有利于rhTNF α的表达和减少包涵体的形成.
