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重组弓形虫磷酸甘油酸变位酶2联合IL-2、IFN-γ佐剂鼻内免疫小鼠诱导的小肠黏膜免疫应答
为探讨IL-2和IFN-γ的佐剂效应,本研究观察了重组弓形虫磷酸甘油酸变位酶2(rTgPGAM2)联合IL-2或IFN-γ滴鼻免疫小鼠诱导小肠黏膜IgA抗体分泌细胞(IgA-ASCs)和小肠冲洗液sIgA的免疫应答.将48只6周龄雌性BALB/c小鼠随机均分为6组,免疫组分别用500 IU IL-2、1000 U IFN-γ、30 μg rTgPGAM2、30 μg rTgPGAM2+500 IU IL-2或30 μg rTgPGAM2+1000 U IFN-γ滴鼻免疫小鼠,抗原和佐剂溶于20 μL PBS中,对照组用20 μL PBS滴鼻.免疫3次,一免和二免间隔2周,二免后1周三免.三免后第14天,颈椎脱臼处死小鼠,免疫组化检测小鼠十二指肠、空肠和回肠黏膜中IgA-ASCs,计算阳性率,ELISA测定小肠冲洗液sIgA水平.结果表明,免疫组十二指肠、空肠和回肠黏膜中IgA-ASCs 阳性率高于PBS组,其中rTgPGAM2、rTgPGAM2联合IL-2或IFN-γ佐剂组差异显著(P<0.05或P<0.01).rTgPGAM2联合IL-2或IFN-γ佐剂组小肠冲洗液sIgA水平显著高于PBS组(P<0.01).rTgPGAM2、TgPGAM2+IL-2和TgPGAM2+IFN-γ滴鼻免疫小鼠均可有效诱导肠黏膜免疫应答,IL-2和IFN-γ可显著增强抗原的免疫效应,IL-2的佐剂效应优于IFN-γ.
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空肠弯曲菌peb1A与大肠埃希菌ltB基因融合基因的构建、表达及鉴定
目的 采用重叠PCR方法将大肠埃希菌不耐热肠毒素B亚单位ltB基因和空肠弯曲菌外膜蛋白peb1A基因进行连接,构建ltB-peb1A融合基因原核表达系统,对其进行诱导表达与鉴定. 方法 利用PCR技术扩增ltB与peb1A基因,用重叠PCR法将ltB与peb1A基因进行融合,然后插入pET-28a(+)中,构建原核表达载体pET28a(+)-LtB-peb1A.用重组体转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达重组蛋白LTB-PEB1,SDS-PAGE分析重组蛋白表达情况,ELISA法鉴定其与牛Gm1活性,Western blot鉴定重组蛋白的反应原性. 结果 PCR及测序证实ltB-peb1A融合基因原核表达载体pET28a(+)-LtB-peb1A构建成功,SDS-PAGE分析目的蛋白高表达量占全菌总蛋白的28％左右,其分子质量单位为40.7 ku.ELISA法鉴定纯化的重组蛋白与牛Gm1有结合活性,Western blot分析重组蛋白能被兔抗空肠弯曲菌识别. 结论 成功构建了ltB-peb1A融合基因原核表达载体,并获得高效表达的目的蛋白,为空肠弯曲菌黏膜免疫疫苗的研制奠定了基础.
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霍乱毒素作为黏膜佐剂的研究进展
霍乱毒素(cholera toxin,CT)是霍乱弧菌分泌的一种不耐热肠毒素,既是强黏膜免疫原,又具有很强的黏膜佐剂活性,是当今研究多且深入的黏膜免疫佐剂之一.然而,由于CT其毒性,限制了在人体的使用.很多研究致力于使CT的佐剂性与毒性分离,CT亚基的佐剂性的研究就是方向之一.困扰黏膜疫苗的一个重要问题是很多抗原的黏膜免疫原性较弱,不能刺激有效的免疫反应,这也与黏膜免疫耐受有关,以CT为佐剂能消除机体对这些共免疫原的耐受.
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黏膜传递系统和黏膜佐剂研究进展
黏膜传递系统和佐剂被认为是疫苗的重要组成部分.多年来,这一领域的研究不断深化,包括作为传递系统的重组减毒活细菌或病毒、质粒DNA、脂质体,以及霍乱毒素和大肠杆菌不耐热肠毒素等传统的黏膜佐剂.但由于这些物质存在着毒副作用等局限性,新的更加有效和安全、经济的黏膜传递系统和佐剂一直是人们探索的目标.本文拟对一些近年有关菌影、芽孢等新的黏膜传递系统以及ADP核糖基化肠毒素类佐剂及单磷酰脂质A、CpG-ODN等佐剂新的进展简介如下.
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黏膜疫苗的研究现状与进展
目的 黏膜系统是引起传染性疾病的病原微生物进入人体的主要渠道,而通过黏膜途径免疫的疫苗能够在病原体入侵的初阶段产生免疫保护作用,更加经济有效.笔者对黏膜疫苗的研究现状与进展进行综述.方法 检索CNKI,Pubmed数据库文章中以“黏膜疫苗,黏膜佐剂,黏膜微粒递送载体”或“mucosal vaccine,mucosal adjuvant,mucosal particulate delivery vectors”为检索词进行检索.结果 灭活或减毒黏膜疫苗以及一些新型疫苗如亚单位疫苗、病毒样颗粒疫苗、病毒小体疫苗等已有批准上市的疫苗品种,相关研究工作还在不断进行.目前许多研究都在探寻黏膜疫苗中安全有效的佐剂和疫苗递送载体,它们能够以不同作用机制加强黏膜疫苗诱发产生的免疫保护作用.微粒递送载体的组成、大小、表面化学性质及其连接的功能配基对它作为递送载体都有着至关重要的影响,几种微粒递送载体目前取得了很大的研究进展.结论 虽然黏膜疫苗的研究与开发还面临着众多的困难与挑战,黏膜疫苗相关研究工作的进展,将给黏膜疫苗的开发带来新的发展机遇.
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CpG ODN联合STAg免疫小鼠诱导黏膜IgA免疫应答
目的 观察GpG寡核苷酸(CpG ODN)联合刚地弓形虫可溶性速殖子抗原(soluble tachyzoite antigen,STAg)滴鼻免疫BALB/c小鼠诱异的不同黏膜部位IgA免疫应答动态变化,探讨CpG ODN作为弓形虫复合黏膜疫苗的佐剂效应.方法 雌性BALB/c小鼠72只,随机分为实验组和对照组,每组36只.实验组以10 μg CpG ODN联合20μg STAg滴鼻免疫,对照组以磷酸盐缓冲液(PBS)滴鼻.间隔2周,免疫2次,于末次免疫后第1,2,3,4,5,6周分别随机处死小鼠(6只/组).ELISA法测定鼻咽冲洗液、肺冲洗液、小肠冲洗液、阴道冲洗液IgA.结果 实验组小鼠各部冲洗液中IgA平均水平高于对照组.鼻咽冲洗液中IgA水平在第1周时高,各时间点虽高于对照组,但差异无统计学意义.肺冲洗液IgA在第5周达到高峰,第4,5,6周高于对照组(P<0.001).小肠冲洗液中弓形虫特异性IgA抗体水平在各个时间点均高于对照组,第2,3周(P<0.001),4周(P<0.05)差异有统计学意义.阴道冲洗液IgA在免疫后第1～6周显著高于对照组(P<0.01),第5周时水平高.结论 CpG ODN作为STAg的佐剂滴鼻免疫BALB/c小鼠可诱异黏膜部位产生高水平IgA抗体,且可持续较长时间.
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大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的原核表达及活性鉴定
目的 克隆大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(ltB)基因,构建其原核表达质粒,并对表达产物进行活性鉴定.方法 采用PCR技术从产毒大肠杆菌129株基因组DNA中扩增ltB基因,克隆入载体pET-32a(+)中,构建原核表达质粒pET-32a(+)-ltB,转化E. Coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,Ni2+-NTA树脂层析柱进行纯化,纯化产物采用ELISA法鉴定其与牛GM1的结合活性.结果 重组表达质粒经菌落PCR鉴定证明构建正确,所克隆的ItB基因与GenBank中报道的相应核苷酸序列的同源性为99.9%.重组菌诱导4 h,目的 蛋白表达量高,约占菌体总蛋白的25%.纯化的重组LTB蛋白纯度约为96%,具有与牛GM1特异性结合的生物学活性.结论 已成功克隆了ltB基因,并构建了其原核表达质粒,表达的重组蛋白具有一定的生物学活性.
关键词： 大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位 原核表达 黏膜佐剂 -
重组人干扰素γ联合弓形虫STAg鼻内免疫小鼠的免疫保护作用
目的 观察重组人干扰素γ(IFNγ)联合可溶性速殖子抗原(STAg)鼻内免疫小鼠诱导的黏膜和系统免疫应答及抗弓形虫感染作用.方法 将BALB/c小鼠随机分为STAg组、STAg+IFNγ组和对照组,分别用20μg STAg、20μg STAg+1 000 U IFNγ和20 μl PBS鼻内免疫2次,间隔14 d.末次免疫后第10天,用RH株弓形虫速殖子灌胃攻击(4×104个/只),观察小鼠存活情况,并计算存活率,攻击后第43天处死全部小鼠,计数肝、脑组织内弓形虫速殖子虫荷,分离并计数肠上皮淋巴细胞(iIELs)、派伊尔氏结(PP)和脾淋巴细胞,ELISA法检测小鼠粪便弓形虫特异性sIgA和血清IgG水平.结果 IFNγ联合STAg鼻内免疫能保护小鼠抵抗弓形虫攻击,小鼠存活率(93%)明显高于STAg组(60%)和对照组(47%);小鼠iIELs(1.81×105)、PP(3.21×107)和脾(3.01×107)淋巴细胞均显著增生,明显高于STAg组和对照组;粪便中sIgA水平(A492=0.435)显著高于对照组(A492=0.047),血清IgG水平(A492=0.233)显著高于STAg组(A492=0.193)和对照组(A492=0.115);肝、脑组织内弓形虫速殖子虫荷显著减少,分别比对照组减少80.90%和64.50%.结论 IFNγ联合STAg鼻内免疫效果优于单独STAg免疫,IFNγ能协同STAg有效诱导黏膜和系统免疫应答,提高弓形虫攻击小鼠的存活率,降低肝、脑组织内虫荷.
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暴露N端对趋化因子LTN黏膜佐剂作用的影响
我们前期构建了编码CVB3结构蛋白VP1的真核表达质粒(pVP1),通过滴鼻免疫诱导了一定水平的细胞和体液免疫应答.为了进一步增强其免疫效果,我们在该黏膜疫苗中引入新型黏膜佐剂LTN,发现当两种质粒共免疫时可显著增强pVP1诱导的CVB3特异性血清IgG和黏膜IgA水平,促进脾脏及黏膜局部IFN-γ+T细胞产生,显著减轻CVB3感染小鼠心肌病理损伤.随后我们对该疫苗体系进行了优化,使用双顺反子形式将编码VP1和LTN的基因构建在同一质粒上,通过滴鼻免疫小鼠后同样获得了免疫增强作用;当尝试将LTNN端融合至VP1蛋白,以该融合质粒pVP1-LTN滴鼻免疫小鼠后发现其增强免疫应答的能力显著下降；为排除融合蛋白空间构象改变及空间位阻对LTN佐剂功能的影响,我们在蛋白连接处引入柔性接头肽段(G4S)3,构建了融合质粒pVP1-IRES-LTN,发现该疫苗增强全身及黏膜局部特异性抗体细胞免疫应答的能力也非常有限,与pVP1-LTN相比并无明显差异,因此不能有效清除心肌病毒和减轻心肌损伤,提示融合蛋白的空间位阻或构像改变并非是影响LTN佐剂效应的关键因素,而暴露的LTNN端对其增强全身及黏膜局部免疫应答强度、提高心肌炎的免疫保护作用十分关键.
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大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位作为黏膜免疫佐剂的研究
大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)是大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)的组成部分之一,具有免疫原性,但无毒性,是一种较为理想的黏膜免疫佐剂.本文就大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的分子结构、介导的免疫反应及其黏膜免疫佐剂效应作一综述.
关键词： 肠产毒型大肠埃希菌 不耐热肠毒素B亚单位(LTB) 黏膜佐剂 黏膜免疫 -
黏膜疫苗及其佐剂的研究进展
黏膜疫苗可以通过激活机体黏膜和系统的免疫应答而阻止病原微生物的入侵,还可通过诱导抗原特异性的黏膜耐受而选择性地治疗自身免疫性疾病、变态反应性疾病及感染性的免疫病理紊乱等.无论是感染性疾病的预防还是自身免疫性疾病的免疫治疗,黏膜疫苗都离不开黏膜佐剂或抗原运输载体.该文从黏膜部位的基本结构出发,探讨了设计黏膜疫苗所必需之处,重点介绍了黏膜佐剂或抗原运输载体的新研究状况.
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枯草芽孢杆菌芽孢佐剂免疫途径及效果的动物实验观察
目的 探讨以表面展示免疫球蛋白结合蛋白功能域(FDIBP)的枯草芽孢杆菌芽孢制备的黏膜佐剂不同途径免疫的应用效果.方法 分别将表面展示FDIBP的重组枯草芽孢杆菌芽孢及大肠杆菌不耐热毒素(LT)与人IgG(hIgG)作为佐剂共孵育制备疫苗,通过灌胃、滴鼻途径免疫BALB/c小鼠,5周后收集外周血、肺泡、小肠及阴道冲洗液.采用ELISA方法检测血清中IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ抗hIgG特异性IgG抗体,同时检测血清及肺泡、小肠、阴道冲洗液中抗hIgG特异性IgA抗体水平.结果 与无佐剂免疫者比较,枯草芽孢杆菌芽孢佐剂滴鼻能有效提高小鼠体液免疫产生的抗原特异性抗体IgA及IgG水平(P＜0.01),但未能有效刺激细胞免疫上调血清IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ水平;通过灌胃途径免疫者上述特异性抗体及细胞因子水平均无显著变化(P均＞0.05).结论 展示FDIBP的枯草芽孢杆菌芽孢可用作滴鼻途径黏膜疫苗佐剂,能有效刺激机体产生特异性黏膜免疫反应.
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热不稳定大肠杆菌肠毒素B亚单位免疫调节功能的实验研究
目的:探讨大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚单位(LTB)的免疫调节功能及其可能的机制.方法:用Sephacryl S-100凝胶柱层析纯化LTB蛋白. 选用BALB/c小鼠,以鸡溶菌酶(HEL)为抗原,经鼻黏膜单独免疫,或以不同剂量的LTB为佐剂与HEL共免疫.用ELISA法检测血清和肠分泌液中HEL特异性抗体的水平.用3H-TdR掺入法,体外测定 LTB蛋白对刀豆蛋白A(ConA)及同种异体抗原介导的淋巴细胞增殖反应的影响. 结果:HEL单独免疫组血清中仅有弱的抗HEL IgG,未检测到抗HEL IgA,且其肠分泌液中亦未见HEL特异性IgA抗体.但加用LTB佐剂的3个组,其血清中抗HEL IgG、 IgA 的水平及肠分泌液中抗HEL IgA的水平均显著高于HEL单独免疫组(P<0.001).体外实验显示,LTB可明显抑制ConA及同种异体抗原介导的淋巴细胞增殖反应. 结论:我们制备的LTB蛋白对免疫系统具有双向的调节功能,既可作为有效的黏膜佐剂,辅佐外来抗原刺激机体产生黏膜免疫应答,又具免疫抑制效应,有效地抑制淋巴细胞活化.LT B免疫调节功能的发挥,可能与其作用于机体的途径有关.
