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人细胞色素P450 2B6的异源表达及活性分析
目的 获得有活性的人CYP2B6重组酶,用于进一步药物代谢研究.方法 采用Bac-to-Bac杆状病毒介导的昆虫细胞表达系统进行人CYP2B6重组酶的表达,采用His抗体进行蛋白质印迹分析.安非他酮作为底物进行重组酶活性测定,高效液相色谱法测定其含量.结果 蛋白质印迹分析检测到带有His标签的CYP2B6重组酶的表达,重组酶对安非他酮的Km值为(138±42)μmol·L-1,Vmytx值为(676±21)pmol·min-1·mg-1蛋白.结论 杆状病毒表达系统能成功表达有活性的CYP2B6重组酶,可用来进一步研究在药物代谢中的作用.
关键词： 细胞色素 P450 2B6 杆状病毒 高效液相色谱 安非他酮 -
蚯蚓纤溶酶PI239基因在杆状病毒中的表达
利用基因重组技术将PI239基因通过细菌/杆状病毒(Bac-to-Bac)表达系统构建重组杆状病毒表达载体,载体采用苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒,将重组病毒转染昆虫Sf9细胞,细胞出现明显病变.SDS-PAGE电泳可以见到相对分子质量3.0万位置有蛋白表达,免疫印记结果表明该条带可以与PI239抗体反应.提示蚯蚓纤溶酶PI239重组蛋白已经获得表达,为进一步研究蚯蚓纤溶酶PI239基因的生物学活性奠定了基础.
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猕猴B病毒gB和gC合成基因重组杆状病毒质粒的构建
目的 构建猕猴B病毒gB和gC合成基因的杆状病毒重组质粒(rBacmid).方法 根据本室已经合成的猕猴B病毒gB基因和gC基因,利用BamHI和XhoI特异性酶切,将其亚克隆于昆虫杆状病毒的pFastBacHTA转座载体.将该阳性转座载体转化到DH10bac感受态细胞,从中筛选出阳性重组细菌,并提取重组质粒.结果 获得了重组质粒bacmid-gB和bacmid-gC.结论 该研究为猕猴B病毒gB和gC蛋白在杆状病毒系统内的表达奠定了基础.
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检测重组hIL-12病毒滴度的空斑方法的建立
目的:建立检测重组hIL-12病毒滴度的空斑方法.方法:将一定浓度的Sf9细胞接种培养皿,待细胞完全贴壁后加入能表达hIL-12的重组杆状病毒感染Sf9细胞,一定时间后吸弃病毒液,加入预温到40℃的含0.5%低熔点琼脂、10%FBS以及其他添加剂的TC-100培养基,凝固后置于27℃条件下,培养5~7 d.结果:确定细胞接种数量为9×105个/皿,病毒液接种体积为500 μl,感染时间为4 h进行病毒感染,用中性红染色即可用肉眼观察到空斑,空斑为圆形无色,直径为0.5~3.0 mm.结论:通过控制病毒液的接种体积和病毒的感染吸附时间,可以提高重组杆状病毒空斑方法的稳定性和准确性.
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O型口蹄疫病毒VP1基因在昆虫细胞/杆状病毒中的表达
目的口蹄疫病毒的VP1蛋白是诱导中和抗体及激发保护性免疫应答的主要抗原蛋白,利用Bac-toBac杆状病毒表达系统表达VP1基因,为建立O型口蹄疫抗体血清学诊断方法奠定基础.方法将O型口蹄疫病毒VP1基因插入pFastBacHIa载体,构建重组质粒pFast BacHIa-VP1.将该重组质粒转化DH10Bac感受态细胞,VP1基因与Bacmid发生特异性位点转座.经PCR鉴定证实VP1基因正确地插入到病毒基因组多角体蛋白基因启动子下游,提取阳性质粒转染Sf9昆虫细胞.结果 SDS-PAGE电泳和Western blot检测结果表明VP1基因成功地在Sf9昆虫细胞中进行了表达,蛋白分子量为26.4kDa.结论 VP1基因在Bac-to-Bac系统中的成功表达为口蹄疫病毒VP1蛋白的抗原性、免疫原性以及免疫抗体水平检测研究奠定了基础.
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不同基因载体转导人骨髓间充质干细胞比较
目的 比较腺病毒载体、腺相关病毒载体、杆状病毒载体和质粒载体对人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)的转导效率.方法 体外原代培养hBMSCs,进行腺病毒载体、腺相关病毒载体、杆状病毒载体和质粒载体转染实验.采用倒置荧光显微镜及流式细胞仪检测经基因载体转染后的hBMSCs胞内目的 蛋白表达情况.结果 倒置荧光显微镜观察结果显示,基因载体转染后的部分hBMSCs胞内有GFP表达而发绿色荧光,其中杆状病毒转导的hBMSCs荧光强度较强.流式细胞仪检测结果表明,腺病毒载体、腺相关病毒载体及质粒载体的转导效率和绿色荧光蛋白阳性细胞平均荧光强度分别是42%,37%,22%和158,115,77,均明显低于杆状病毒的70%(P＜0.01)和212(P＜0.05).结论 杆状病毒载体对hBMSCs的转导效率高于腺病毒载体、腺相关病毒载体和质粒载体,有望成为人体基因治疗研究中更为理想的基因载体.
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KIF18A杆状病毒表达系统的构建与鉴定
目的 KIF18A蛋白是调节有丝分裂和影响肿瘤发生发展的重要蛋白,本研究旨在建立KIF18A蛋白昆虫杆状病毒表达系统,从而可在体外高效合成KIF18A蛋白.方法 先用分子克隆方法构建转移载体,然后通过基因转座作用得到重组杆状病毒,后将重组杆状病毒转入昆虫细胞Sf-9以高效合成KIF18A蛋白.结果 经过DNA测序、倒置显微镜下细胞观测和Western Blot检测验证分析,证实已成功建立了KIF18A蛋白昆虫杆状病毒表达系统.结论 明确了KIF18A杆状病毒表达系统中转移载体构建和重组病毒转染等条件,建立了高效表达KIF18A的杆状病毒表达系统.
关键词： KIF18A蛋白 杆状病毒 Bac-to-Bac -
卡瓦胡椒对c-DNA已表达的细胞色素P450酶及低温贮存的人肝细胞的影响
有研究显示卡瓦胡椒Piper methysticum Forster f.中的几种化合物对P450酶显示强抑制作用,并可能通过其活性代谢物的生成产生致死性肝毒性.作者研究了该植物根乙醇提取物及3种卡瓦内酯类成分醉人素(methysticin)、去甲氧基麻醉椒素(desmethoxyyangonin)和麻醉椒素(yangonin)体外对在杆状病毒/昆虫细胞系(重组CYPs)和低温保存的人肝细胞中已表达的P450酶活性的抑制作用.
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人细胞色素CYP2E1基因重组杆状病毒粘粒构建
目的 构建人细胞色素P450 2E1(CYP2E1)基因cDNA重组的杆状病毒粘粒.方法 采用PCR方法,从国外获赠的含有CYP2E1基因cDNA的质粒中扩增CYP2E1 cDNA.将该基因的cDNA连接到测序载体pCMV-Myc载体上,通过内切酶分析及测序加以鉴定,然后将该基因的cDNA克隆到转座载体pFASTBac1载体,转化入DH10Bac大肠埃希菌感受态细胞中,提取含有CYP2E1基因的重组杆状病毒粘粒,并经PCR鉴定分析.结果 测序结果显示,该克隆片段含有CYP2E1完整的编码区,所获得的重组杆状病毒粘粒含有完整1.5kb大小的该片段.结论 获得重组CYP2E1杆状病毒粘粒,为下一步转染昆虫细胞,利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统大量表达人细胞色素P450 2E1蛋白打下基础.
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应用杆状病毒表达系统在Sf9昆虫细胞中重组表达Legumain蛋白
目的 通过昆虫-杆状病毒表达系统表达获得Legumain蛋白,为进一步研究其在葡萄膜黑色素瘤中的作用建立基础.方法 实验研究.对2011年4月至2012年1月在陕西省眼科中心应用克隆Legumain蛋白基因,并将其基因片段插入pFastBac载体获得重组载体,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞后得到重组Bacmid,转染昆虫Sf9细胞,Western Blotting印迹和SDS-PAGE检测重组蛋白的表达.结果 获得了Legumain蛋白的重组杆状病毒;Western Blotting印迹和SDS-PAGE分析表明,该重组杆状病毒感染昆虫Sf9细胞后表达Legumain蛋白,与预期结果一致.结论 通过昆虫-杆状病毒表达系统可成功获得Legumain蛋白,从而为进一步研究其在葡萄膜黑色素瘤侵袭与转移机制的作用奠定了工作基础.
关键词： 杆状病毒 表达系统 Sf9昆虫细胞 Legumain蛋白 -
红光熊蜂蜂毒蛋白酶的基因克隆和表达
目的 克隆表达序列标签(ESTs)中筛选出的红光熊蜂蜂毒蛋白酶(BiVP)基因,在草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞Sf-9中进行表达.方法 利用ESTs从红光熊蜂cDNA文库中获得BiVP基因,以PCR技术扩增出BiVP的完整cDNA,并构建病毒表达载体PBacl-BiVP,通过昆虫杆状病毒表达系统,在Sf-9昆虫细胞中进行表达,表达产物用快速蛋白液相色谱(FPLC)系统进行纯化.结果 成功克隆BiVP基因并在Sf-9昆虫细胞中得到表达,表达产物纯化后经SDS-PAGE检查为单一条带.结论 首次在红光熊蜂中克隆到蜂毒蛋白酶基因,在昆虫杆状病毒表达系统中进行了表达,并对表达产物进行了纯化,为深入研究BiVP的生物活性奠定了基础.
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SASR-CoV核衣壳蛋白在杆状病毒-昆虫系统的克隆表达及抗原性分析
目的：SARS冠状病毒（ SARS-CoV）核衣壳蛋白（ N蛋白）在杆状病毒-昆虫系统的表达，研究其抗原性。方法：利用PCR方法扩增SARS-NP全长基因，使用BamHⅠ和Sal Ⅰ限制性内切酶定向插入Bac-to-Bac系统的pFastBac HTC载体，构建重组质粒转化DH10 Bac细胞，获得重组杆粒DNA后转染Sf9细胞，在High Five细胞中表达SARS-NP；表达产物经Ni-NTA亲和层析纯化及免疫印迹和ELISA方法验证抗原性。结果：成功构建pFastBac HTC-SARS-NP重组质粒，并在High Five细胞高效表达，获得相对分子量约48 kD的重组蛋白质。经验证，重组蛋白能被SARS-CoV NP的特异性单抗（8E1A17）和兔免疫血清识别，能与SARS患者血清反应，与健康人血清、人冠状病毒229 E型和OC43型的杂交瘤培养上清、相对应的兔免疫血清、患者血清均无交叉反应，具良好抗原反应性。结论：SARS-NP成功表达于杆状病毒-昆虫系统，具较强抗原反应性，初步认为其与229 E型和OC43型感染血清无交叉反应性。
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hTERT启动表达VacA基因的重组杆状病毒载体的构建
目的 构建人端粒酶逆转录酶启动子(hTERT)调控的、携带幽门螺杆菌细胞空泡毒素A(Vacuolatingcytotoxin A,VacA)基因的选择性表达重组杆状病毒.方法 应用酶切、连接方法将hTERT连接于杆状病毒穿梭质粒pFastBacTM DUAL载体P10启动子序列之后,和SV40分别调控目的基因VacA的表达和终止;将重组穿梭质粒电转入DH10BacTME.coli感受态细胞,经转座重组获得重组杆粒Bacmid-VacA.利用脂质体Cellfectin(R)将重组杆粒转染Sf9昆虫细胞,包装重组杆状病毒.结果 应用PCR验证、双酶切分析、序列测定等方法验证重组质粒基因片段连接正确无突变,通过转座重组获得携带有VacA基因片段的重组杆粒.结论 携带VacA基因的选择性复制重组杆粒成功构建.
关键词： 杆状病毒 空泡毒素A 人端粒酶逆转录酶启动子 -
脊髓灰质炎病毒Sabin2株结构蛋白VP1在昆虫杆状病毒表达系统中的表达
目的 在昆虫杆状病毒表达系统中表达脊髓灰质炎病毒(Poliovirus,PV)Sabin2株结构蛋白VP1.方法 从Sabin2疫苗原液中RT-PCR扩增PV结构蛋白VP1基因.克隆入pFastBac1质粒,转化含杆状病毒穿梭载体Bacmid的E coli DH 10Bac,获得重组杆状病毒表达质粒Bacmid-VP1,在脂质体介导下转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBac-VP1.将第2代rBac-VP1感染sf9细胞,间接免疫荧光法检测VP1蛋白的表达,并优化感染条件.结果 重组杆状病毒表达质粒.Bacmid-VP1转化子可扩增出3 203 bp的目的 片段;第2代rBac-VP1的滴度为6×107 pfu/ml,其感染的sf9细胞在荧光显微镜下可见绿色荧光,以不同MOI的rBac-VP1感染sf9细胞,VP1蛋白表达量差别不大,而在96 h内,随着感染时间的延长,VP1蛋白的表达量逐渐升高.结论 在昆虫杆状病毒表达系统中成功表达了PV Sabin2株结构蛋白VP1,为脊髓灰质炎亚单位疫苗的研制奠定了基础.
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牛副流感病毒3型血凝素-神经氨酸酶蛋白在杆状病毒中的表达
目的 在杆状病毒中表达牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type-3,BPIV-3)血凝素-神经氨酸酶蛋白(hemagglutinin-neuraminidase,HN).方法 提取BPIV-3 BN-1株RNA,设计特异性引物扩增HN全长ORF,将其克隆至杆状病毒供体载体pFastBacHTA中,获得重组供体质粒pFastBac-HN.将pFastBac-HN转化至感受态细胞E.coli DH10Bac,制备穿梭质粒Bacmid-HN.将纯化的Bacmid-HN经脂质体转染至Sf21昆虫细胞,拯救重组杆状病毒,并进行Western blot鉴定.结果 经PCR及测序鉴定证明,HN基因重组供体质粒pFastBac-HN及穿梭质粒Bacmid-HN构建正确.利用Sf21昆虫细胞成功拯救重组杆状病毒,连续传代扩增3代的病毒滴度为2×108 CPE/ml.重组HN蛋白的相对分子质量约70 000,可与BPIV-3阳性血清发生特异性反应.结论 在杆状病毒表达系统中成功表达了BPIV-3重组HN蛋白,为BPIV-3的诊断及疫苗效力评价奠定了基础.
关键词： 牛副流感病毒3型 血凝素-神经氨酸酶蛋白 杆状病毒 真核细胞 基因表达 -
抗乙型肝炎病毒表面抗原的IgG全抗体表达载体的构建
目的 构建抗乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的IgG全抗体杆状病毒表达载体.方法 用PCR方法扩增抗HBsAg 抗体Fab片段的轻链(L)及重链Fd段(VH+CH1)基因片段,将杆状病毒载体pAC-k-Fc与L基因连接,重组为过渡表达载体pAC-k-L-Fc,再与Fd基因连接,构建重组表达载体pAC-HBs-Fc,并进行酶切鉴定及DNA测序分析.确定正确后,转染昆虫细胞sf9,用免疫荧光检测IgG的表达.结果 PCR扩增的片段约650 bp,与预期值一致.载体pAC-k-L-Fc和pAC-HBs-Fc的酶切片段和DNA序列与预期结果一致.转染sf9细胞呈阳性荧光反应,未转染细胞呈阴性荧光反应.结论 已成功构建表达载体pAC-HBs-Fc,为表达抗人HBsAg的IgG全抗体奠定了基础.
关键词： 乙型肝炎病毒表面抗原 基因工程抗体 杆状病毒 -
人源抗乙型肝炎病毒表面抗原基因工程IgG全抗体的表达、纯化及初步鉴定
目的 对人源抗乙型肝炎病毒表面抗原的基因工程IgG全抗体进行表达、纯化及初步鉴定.方法 用含Fc片段抗-HBsAg Fab抗体基因的载体pAC-HBs-Fc,与杆状病毒线性DNA共转染昆虫细胞sf9,产生重组抗-HBsAg的全抗体.以不同浓度的HBsAg包被酶标板孔,用间接ELISA法检测培养上清中抗体的表达及特异性;用蛋白G亲和层析柱进行抗体的纯化,并对纯化的抗体进行SDS-PAGE、Western blot和竞争性ELISA分析.结果 上清中表达的重组IgG抗体仅与HBsAg呈阳性反应,特异性良好,纯化后其纯度达97.1%.经SDS-PAGE和Western blot分析可见,IgG抗体轻链和重链的相对分子质量分别约为27000和55000,为人源IgG抗体.CHO表达的HBsAg和血源性HBsAg能竞争性抑制该重组IgG抗体与E.coli表达的HBsAg反应,其抑制率分别为55.9%和81.9%.结论 人源抗乙型肝炎病毒表面抗原的基因工程IgG全抗体可在杆状病毒载体表达系统中成功表达.
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人源溶菌酶基因在杆状病毒系统中的表达
目的 在杆状病毒系统中表达人源溶菌酶(Human lysozyme,hLY)基因,为其临床应用和大规模生产奠定基础.方法 将人工合成的含信号肽和不含信号肽的溶菌酶基因克隆至重组杆状病毒表达系统的载体中,构建重组穿梭质粒,转染sf9细胞,SDS-PAGE和Western blot验证蛋白的表达,溶菌试验验证表达产物的溶菌酶活性.结果 重组克隆质粒PFastBac HTA-signal-lysozyme和PFastBac HTA-lysozyme的PCR产物分别可见444和393 bp的目的基因条带,测序结果证实重组克隆质粒构建正确.PCR结果显示Lysozyme-1、Lysozyme-2、slysozyme-1、slysozyme-2、slysozyme-3、slysozyme-4号重组穿梭质粒可扩增出目的条带.sf9-PHLY和sf9-PHSLY的表达产物经12％ SDS-PAGE分析,分别可见相对分子质量约17500和19300的特异蛋白条带；表达的两种重组蛋白均可与鼠抗6×His单抗特异性结合；表达产物具有溶菌酶活性.结论 成功在杆状病毒表达系统中表达了hLY基因,为其临床应用和大规模生产奠定了基础.
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甲型流感病毒血凝素基因在昆虫杆状病毒系统中的表达
目的 利用昆虫杆状病毒系统表达甲型流感病毒血凝素( Hemagglutinin,HA)蛋白.方法 PCR扩增去除信号肽的甲型H1N1(A/PR/8/34)流感病毒HA基因,与pFastBacdual载体(pFBd)连接,构建转移载体pFBd-HA,转化含Bacmid的DH 10Bac感受态细胞,获得穿梭质粒rBacmid-HA.rBacmid-HA转染sf9昆虫细胞,获得重组病毒rBac-HA.采用噬斑形成法检测病毒滴度,PCR法检测重组杆状病毒基因组HA基因,间接免疫荧光法、Western blot法和ELISA法检测HA蛋白的表达.结果穿梭质粒rBacmid-HA经PCR鉴定构建正确；第3代rBac-HA的滴度为3×107pfu/ml;感染rBac-HA的sf9细胞经PCR扩增可见4 216 bp的特异性条带,间接免疫荧光检测可见绿色荧光,Western blot鉴定与鼠抗甲型流感病毒HA( H1)单抗和鸡抗流感病毒(California株)多抗发生特异性反应,ELISA检测与鼠抗流感病毒(PR8株)多抗特异性结合的能力强于与鸡抗流感病毒(California株)多抗结合的能力.结论 利用昆虫杆状病毒表达系统成功表达了甲型流感病毒HA蛋白.
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人MC1R基因在杆状病毒-昆虫细胞表达系统中的表达
目的利用杆状病毒表达系统进行人恶性黑色素瘤A375细胞MC1R基因在Sf9昆虫细胞中的表达.方法以pMD18-T-MC1R为模板,利用PCR方法扩增人MC1R基因,将MC1R基因连接到pfastBac1质粒上,与穿梭载体DH10Bac转座,获得Bacmid-MC1R质粒后,通过脂质体介导,转染Sf9细胞,使其表达重组杆状病毒,经SDS-PAGE检测表达产物,放射受体分析法检测目的蛋白MC1R活性.结果Bacmid-MC1R质粒转染Sf9细胞后的SDS-PAGE图谱,在相对分子质量为35 000处有一条新生蛋白带.放射受体分析结果显示表达的蛋白与标记配体特异亲和,具有生物学活性.结论MC1R基因成功在真核细胞中得到表达.
