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口服携带人IL-12、GM-CSF基因的减毒沙门菌抗肿瘤作用的试验
目的探讨以减毒沙门菌作为口服基因治疗载体的可行性. 方法通过电转化法将真核表达载体pCMVhIL-12、pCMVhGM-CSF、EGFPN1导入减毒鼠伤寒沙门菌SL3261中,经由胃管喂给BALB/c和C57BL/6小鼠.6周后分别用4T1乳腺癌细胞和Lewis肺癌细胞进行攻击.通过流式细胞仪、共聚焦显微镜检测绿色荧光蛋白在小鼠各组织中的表达,通过PCR和ELISA法检测IL-12、GM-CSF基因的整合和表达情况.并考察肿瘤的受抑情况和小鼠的生存期. 结果在小鼠的肝、脾、小肠、肾脏和肿瘤中可检测到绿色荧光蛋白的表达和相应细胞因子基因的整合.血清中相应的细胞因子水平较对照组明显升高(P<0.05),生存期远远超过对照组小鼠(P<0.05). 结论减毒沙门菌可作为口服基因治疗载体,可能为肿瘤的治疗提供一条简便、安全、有效的途径.
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检测重组hIL-12病毒滴度的空斑方法的建立
目的:建立检测重组hIL-12病毒滴度的空斑方法.方法:将一定浓度的Sf9细胞接种培养皿,待细胞完全贴壁后加入能表达hIL-12的重组杆状病毒感染Sf9细胞,一定时间后吸弃病毒液,加入预温到40℃的含0.5%低熔点琼脂、10%FBS以及其他添加剂的TC-100培养基,凝固后置于27℃条件下,培养5~7 d.结果:确定细胞接种数量为9×105个/皿,病毒液接种体积为500 μl,感染时间为4 h进行病毒感染,用中性红染色即可用肉眼观察到空斑,空斑为圆形无色,直径为0.5~3.0 mm.结论:通过控制病毒液的接种体积和病毒的感染吸附时间,可以提高重组杆状病毒空斑方法的稳定性和准确性.
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块茎特异性启动子驱动的hIL-12在转基因马铃薯中的表达
目的 检测人白细胞介素-12(hIL-12)蛋白在转基因马铃薯块茎中的表达量、遗传稳定性以及组织特异性.方法 提取转基因马铃薯块茎与叶片总蛋白,利用hlL-12抗体进行western blot和ELISA检测.结果 在5株转基因马铃薯的块茎中检测到了hIL-12蛋白的表达,表达量高达到3.04 μg/g(总蛋白).此外,同一植株的多个块茎中hIL-12的表达具有一致性,而在叶片中未检测到明显的表达.选取2株马铃薯植株的块茎进行种植,其后代也能检测到稳定的hIL-12蛋白表达.结论 本研究获得了稳定高表达hIL-12蛋白的转基因马铃薯植株,为利用马铃薯生物反应器高效表达生产hIL-12蛋白提供了理论依据.
关键词： 人白细胞介素-12 蛋白表达 植物生物反应器 Ppatatin启动子 -
马铃薯块茎特异性启动子克隆及其驱动的hIL12表达载体构建
目的 克隆马铃薯块茎特异性的高效启动子Ppatatin并构建其驱动的人白细胞介素-12(hIL12)植物表达载体.方法 提取马铃薯基因组DNA作为模板,根据Genebank数据库信息设计Ppatatin序列特异性引物,通过PCR扩增获得Ppatatin片段,并进行测序鉴定;利用PLACE等数据库对序列进行启动子元件分析;通过重叠PCR、限制性内切酶酶切、体外连接、转化等技术,以双元载体pCambia-2301为骨架,构建Ppatatin驱动的hIL12表达载体.结果 成功从马铃薯基因组中扩增得到了1019 bp大小的启动子片段,序列分析表明该片段含有典型的启动子元件如TATA-box,以及一些组织特异性的相关响应元件,符合组织特异性启动子的特征;成功获得了基于pCambia-2301的Ppatatin驱动的hIL12植物表达载体.结论 获得的Ppatatin启动子及其驱动的hIL12表达载体,为提高hIL12在植物生物反应器中表达量以及优化马铃薯生物反应器打下了基础.
关键词： Ppatatin启动子 人白细胞介素-12 表达载体 植物生物反应器 -
从转基因马铃薯中纯化的人白细胞介素-12的生物学活性分析
目的 研究从转人白细胞介素-12(hIL-12)基因马铃薯中纯化的hIL-12的生物学活性.方法 ELISA法测定纯化的hIL-12诱使外周血单个核细胞产生IFN-γ的量.结果 纯化的hIL-12在体外能刺激PBMC产生IFN-γ,而野生对照组无作用.结论 本实验室从转hIL-12基因马铃薯中纯化的hIL-12具有生物学活性.
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人白介素-12植物表达载体的构建
目的:构建人白介素-12(hIL-12)基因的植物表达载体.方法:采用PCR技术从质粒pCA13-hIL-12中扩增hIL-12基因,SmaI, SacI分别酶切hIL-12基因和植物表达载体pBI121,回收,T4DNA连接酶连接得到重组质粒pBI121-hIL-12,双酶切和DNA测序鉴定后,通过三亲杂交法将表达载体pBI121-hIL-12分别导入根癌农杆菌EHA105和GV3101,用PCR法进行鉴定.结果:双酶切及DNA序列测定证实hIL-12已插入到表达载体pBI121中,PCR 扩增表明构建的重组表达载体pBI121-hIL-12成功转入根癌农杆菌EHA105和GV3101中.结论:成功构建了植物表达载体pBI121-hIL-12,为进一步利用转基因植物生产hIL-12奠定了实验基础.
