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禽呼肠孤病毒σC基因在杆状病毒表达系统中的表达及其活性鉴定
本研究利用Bac-To-Bac杆状病毒表达系统构建重组禽呼肠孤病毒(Avian reovirus,ARV)σC基因的杆状病毒,感染sf9细胞获得表达重组蛋白.首先,将ARVσC基因克隆至pFastBacHTA载体,构建重组供体载体pFσC,将其转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,使σC基因整合到Bacmid穿梭载体中,获得重组穿梭载体BacmidσC.通过脂质体介导将其转染到sf9昆虫细胞中,获得重组杆状病毒rBacσC.通过Western Blot、间接免疫荧光试验(IFA)进行检测,结果显示:σC蛋白在重组杆状病毒rBacσC感染的sf9昆虫细胞中获得正确表达,分子质量约为37kD,表达的σC蛋白具有良好的反应活性.
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寨卡病毒E蛋白在重组杆状病毒中的表达
目的 在杆状病毒中表达寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)包膜蛋白(Envelope protein,E蛋白).方法 人工合成ZIKV E基因全长序列(1 518 bp),并克隆到pFastBac1载体上,得到重组杆状病毒转移载体pFB1-E,转化含DH10Bac感受态细胞,获得骨架质粒rBacmid-E,转染sf9细胞,得到重组杆状病毒rBac-E.检测病毒滴度,PCR法检测E基因的插入,间接免疫荧光和Western blot法检测E蛋白的表达.结果 经PCR方法鉴定,重组杆状病毒骨架质粒构建成功,重组病毒rBac-E(第3代)病毒滴度为2.58×105pfu/ml.提取感染rBac-E的sf9细胞基因组,经PCR扩增得到3 830 bp的条带,间接免疫荧光检测出现特异性绿色荧光.Western blot鉴定可见感染重组杆状病毒rBac-E的细胞沉淀中在相对分子质量55×103处有特异性条带.结论 在杆状病毒表达系统中重组表达了ZIKV E蛋白,为ZIKV E蛋白功能研究及疫苗的开发奠定了基础.
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人VEGF基因杆状病毒表达载体的构建及生物学活性鉴定
目的 构建含人血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因的杆状病毒表达载体,并对其表达产物的生物学活性进行测定.方法 用Hind Ⅲ对pcDNA3.1/VEGF进行酶切,回收575 bp的VEGF片段;pFast a载体用Hind Ⅲ酶切回收,与VEGF片段连接.NcoI酶切鉴定方向,得到正向连接重组载体pFast/VEGF;将其转化DH10BAC感受态细胞,经卡那霉素、四环霉素、庆大霉素及蓝白斑筛选得到重组杆状病毒载体pBacmid-Fa-VEGF,PCR扩增鉴定得到单一VEGF条带.将该病毒载体转染sf9细胞,用噬斑筛选及SDS-PAGE和Western blot检测VEGF表达,并通过MTT法检测VEGF促内皮细胞生长活性.结果 病毒液在稀释到10-7时出现噬斑,Western blot检测出现单一条带,MTT检测促内皮细胞生长率为19.44%.结论 成功构建了含VEGF基因的杆状病毒表达载体,且表达产物具有显著的促内皮细胞生长作用.
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检测重组hIL-12病毒滴度的空斑方法的建立
目的:建立检测重组hIL-12病毒滴度的空斑方法.方法:将一定浓度的Sf9细胞接种培养皿,待细胞完全贴壁后加入能表达hIL-12的重组杆状病毒感染Sf9细胞,一定时间后吸弃病毒液,加入预温到40℃的含0.5%低熔点琼脂、10%FBS以及其他添加剂的TC-100培养基,凝固后置于27℃条件下,培养5~7 d.结果:确定细胞接种数量为9×105个/皿,病毒液接种体积为500 μl,感染时间为4 h进行病毒感染,用中性红染色即可用肉眼观察到空斑,空斑为圆形无色,直径为0.5~3.0 mm.结论:通过控制病毒液的接种体积和病毒的感染吸附时间,可以提高重组杆状病毒空斑方法的稳定性和准确性.
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卵巢癌相关基因HFA在杆状病毒表达系统的表达与鉴定
目的:使卵巢癌相关基因HFA在杆状病毒表达系统中获得表达.方法:将卵巢癌相关基因HE4克隆到pMagic-his-HE4中,通过转化E.coli DH10B筛选克隆,阳性克隆通过接合转移的方式与杆状病毒框架质粒体外重组,构建Bac-phes-HE4杆状病毒表达载体,后者经Lipofectamine 2000介导转染Sf 9细胞,获取重组病毒,扩增病毒并感染Sf 9细胞进行表达,SDS-PAGE、Westernblot分析鉴定表达蛋白.结果:经HE4抗体、6×His单抗鉴定,成功通过杆状病毒表达系统获得重组卵巢癌相关基因HE4.结论:卵巢癌相关基因HFA通过接合转移的方法在杆状病毒表达系统中成功表达.
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甲型流感病毒血凝素基因在昆虫杆状病毒系统中的表达
目的 利用昆虫杆状病毒系统表达甲型流感病毒血凝素( Hemagglutinin,HA)蛋白.方法 PCR扩增去除信号肽的甲型H1N1(A/PR/8/34)流感病毒HA基因,与pFastBacdual载体(pFBd)连接,构建转移载体pFBd-HA,转化含Bacmid的DH 10Bac感受态细胞,获得穿梭质粒rBacmid-HA.rBacmid-HA转染sf9昆虫细胞,获得重组病毒rBac-HA.采用噬斑形成法检测病毒滴度,PCR法检测重组杆状病毒基因组HA基因,间接免疫荧光法、Western blot法和ELISA法检测HA蛋白的表达.结果穿梭质粒rBacmid-HA经PCR鉴定构建正确；第3代rBac-HA的滴度为3×107pfu/ml;感染rBac-HA的sf9细胞经PCR扩增可见4 216 bp的特异性条带,间接免疫荧光检测可见绿色荧光,Western blot鉴定与鼠抗甲型流感病毒HA( H1)单抗和鸡抗流感病毒(California株)多抗发生特异性反应,ELISA检测与鼠抗流感病毒(PR8株)多抗特异性结合的能力强于与鸡抗流感病毒(California株)多抗结合的能力.结论 利用昆虫杆状病毒表达系统成功表达了甲型流感病毒HA蛋白.
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截短型人乳头瘤病毒58型L1蛋白在昆虫细胞中的表达
目的 利用昆虫细胞杆状病毒表达系统构建含截短型人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)58型主要衣壳蛋白L1基因的重组杆状病毒,并在Sf9细胞中表达.方法 从NCBI中获得HPV 58 L1基因序列,应用Clustal X2软件进行序列比对后,确定相对保守的目的基因序列;人工合成HPV 58 L1基因片段,PCR法获得截短型HPV58 L1-1基因,克隆至pFastBac-1载体中,构建重组供体质粒pFB-HPV 58 L1-1,转化大肠埃希菌DH10Bac,构建重组Bacmid-HPV 58 L1-1,转染Sf9细胞,获得第1代(P1)重组杆状病毒BV-HPV 58 L1-1,扩增后采用快速滴定法测定病毒滴度;将重组杆状病毒感染Sf9细胞,表达HPV 58 L1-1蛋白,并进行Western blot分析和透射电镜观察.结果 Bacmid-HPV 58 L1-1经PCR及测序鉴定构建正确;P2重组杆状病毒的滴度可达1.0×108 pfu/ml;HPV 58 L1-1在Sf9昆虫细胞中的表达产物经Western blot检测,可见相对分子质量约55 000的特异性反应条带,电镜观察可见L1蛋白自组装形成病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs).结论 成功在昆虫细胞中表达了HPV 58 L1-1蛋白,并自组装为VLPs,为预防型HPV疫苗的研究奠定了基础.
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Sf9细胞的高效扩增及类病毒颗粒高效自组装的培养工艺
目的 优化SFX-Insect培养基及类病毒颗粒(virus like particles,VLPs)的自组装培养工艺,提高Sf9细胞的扩增效率及VLPs的自组装效率.方法 以SFX-Insect培养基作为基础培养基,添加不同营养物(HyPepTM 1510及葡萄糖),优化培养基.分别在摇瓶及WAVE生物反应器中培养Sf9细胞,同时补加不同倍数(1、2、5、8倍)的补料浓缩液,观察细胞培养效果;将重组戊型肝炎杆状病毒分别加入SFX-Insect及优化培养基培养的Sf9细胞中,分析目的蛋白表达量;根据细胞的不同生长阶段、接毒时是否补料及不同接毒MOI值,将优化培养基培养的Sf9细胞进行分组,分析各组细胞中目的蛋白的表达量并观察VLPs的形成.结果 SFX-Insect基础培养基中同时添加10 g/L葡萄糖和10 g/L HyPepTM 1510为Sf9细胞佳培养基.优化培养基摇瓶培养Sf9细胞,活细胞密度高达2×107个/ml以上;在细胞对数生长中后期进行1及2倍补料可延长细胞平台生长期至20 d以上;将摇瓶培养的细胞放大至WAVE生物反应器中培养,密度高达107个/ml以上,且传代培养后,可维持10 d以上的平台生长期.优化培养基培养的Sf9细胞目的蛋白的表达量比SFX-Insect培养基提高了6倍;优化培养基培养Sf9细胞至对数生长中前期,进行补料接毒(MOI=2),VLPs的组装效率大幅提高,镜下可见形态均一的VLPs.结论 成功优化了SFX-Insect培养基及VLPs的自组装培养工艺,提高了Sf9细胞的扩增效率及VLPs产量.
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H1N1亚型流感病毒M1基因重组杆状病毒的构建及鉴定
目的 构建H1N1亚型流感病毒M1基因重组杆状病毒,并进行鉴定.方法 PCR扩增H1N1亚型流感病毒(A/PR/8/34)全长M1基因,与pFastBacdual(pFBD)载体连接,构建重组杆状病毒转移载体pFBD-M1,转化含有Bacimd和Helper 质粒的DH10Bac感受态细胞,获得骨架质粒rBacmid-M1,将其转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBac-M1.采用噬斑形成法检测病毒滴度,PCR法检测M1基因的插入,间接免疫荧光、Western blot和ELISA法检测M1蛋白的表达.结果 重组杆状病毒骨架质粒rBacmid-Ml经PCR鉴定证实构建正确；第3代rBac-M1病毒滴度为3×108 pfu/ml;感染rBac-Ml的sf9细胞经PCR扩增可见3 300 bp的条带,间接免疫荧光检测可见特异性绿色荧光,Western blot检测可与鼠抗流感病毒(PR8)和鼠抗M1蛋白(PR8)多克隆抗体发生特异性反应,ELISA检测M1蛋白可与鼠抗流感病毒(PR8)多克隆抗体发生特异性反应,具有良好的反应原性.结论 已成功构建了H1N1亚型流感病毒M1基因重组杆状病毒,为进一步研究流感病毒M1的功能及新型流感疫苗开发奠定了基础.
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杆状病毒AcMNPV介导BmK IT的表达促进草地夜蛾卵巢Sf9细胞凋亡及病毒在细胞内的复制
昆虫杆状病毒是一类寄生于节肢动物的囊膜包裹的双链环状DNA,杆状病毒作为新型生物杀虫剂逐渐应用于害虫防治.BmK IT是一种从东亚钳蝎分离出来的昆虫毒素,可以与昆虫细胞膜的钠离子通道相互作用,引起钠离子通道动作电位重复发放,并增强钠电流峰值,延缓钠传导关闭,使昆虫产生兴奋性麻痹.为了提高杆状病毒莒蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)杀虫活性,本研究将BmK IT基因插入到AcMNPV基因组中,形成重组杆状病毒AcMNPV-BmK IT.采用MTT法、TUNEL试剂、Westem blot、real-time PCR及病毒滴度测定来检测AcMNPV-BmK IT对草地夜蛾卵巢细胞Sf9发生凋亡及病毒在Sf9细胞内的复制情况.结果显示AcMNPV介导BmK IT的表达促进了Sf9细胞凋亡及病毒复制.此结果为揭示重组病毒AcMNPV-BmK IT的抗虫机制提供了实验依据.
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日本血吸虫翻译控制肿瘤蛋白基因的杆状病毒表达载体构建和在昆虫细胞中的表达
目的构建日本血吸虫的翻译控制肿瘤蛋白(SjTCTP)基因的杆状病毒重组供体质粒pFASTA-TCTP,用该重组转移质粒转化含有杆状病毒表达载体以构建BacmidGFP-TCTP,感染昆虫细胞进行表达.方法将已克隆的SjTCTP基因与线性化的pFASTA进行连接为pFASTA-TCTP,使pFASTA-TCTP与DH10BAC感受菌进行转座重组,利用抗性及蓝白斑筛选重组BacmidGFP-TCTP克隆,提取BacmidGFP-TCTP转染昆虫细胞Sf9获得有感染力的病毒,利用病毒感染Sf9细胞进行蛋白表达,通过荧光镜观察、RT-PCR、SDS-PAGE和Western-Blotting检测表达情况.结果获得了重组SjTCTP的杆状病毒,细胞能表达出与SjTCTP单抗结合的、分子量为23kDa左右的融合有组氨酸标签的目的蛋白.结论 SjTCTP能在昆虫细胞中获得良好表达,为其的分子生物学活性研究奠定了基础.
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丙型肝炎病毒结构蛋白E1在昆虫细胞中的表达及定位
本文在大肠杆菌中表达了与GST融合无跨膜区的丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)E1蛋白,并通过免疫兔制备了兔抗E1的抗血清.然后利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统构建了含有HCV结构蛋白E1基因的重组杆状病毒vAcHCVE1.通过Western blot分析,E1蛋白在Sf9细胞中表达分子量大小为30kDa大于预测的20kDa,表明存在翻译后修饰如糖基化等.通过Confocal显微镜观察当感染48h后E1蛋白定位在细胞质和细胞膜上.
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Bac-to-Bac杆状病毒昆虫表达系统介导的重组腺相关病毒制备
目的 建立高效的临床级重组腺相关病毒( rAAV)制备方法.方法 将rAAV的反向末端重复序列( ITR)及目的基因表达框(2053 bp)从pAAV-MCS剪切引入杆状病毒载体中构建顺式载体,rAAV血清型2的衣壳和复制蛋白基因在反式载体pFastBacDual中利用真核基因遗漏扫描原理表达,两者分别制备成杆状病毒,共感染昆虫细胞sf9包装rAAV.增强绿色荧光蛋白(EGFP)作为报告基因验证其可行性.结果 顺式和反式杆状病毒载体分别在DH 10BacTM中转座形成杆粒bacmid、昆虫细胞sf9中制备成杆状病毒,病毒滴度可达1×108～3 ×108 v.g./ml.二杆状病毒共感染昆虫细胞sf9,完成rAAV拯救、复制和包装过程,经rAAV-EGFP感染293T细胞测试具有良好的生物学活性.结论 该系统具有高效、安全、简便等特点,为临床级rAAV制备和基因治疗奠定了基础.
关键词： 杆状病毒昆虫表达系统 腺相关病毒 sf9细胞 -
小牛血清和胎牛血清对Sf9细胞生长和重组蛋白表达影响的比较
目的:比较小牛血清和胎牛血清对Sf9细胞生长的影响以及两种血清条件下重组蛋白表达的差异,探讨小牛血清用于Sf9细胞培养和重组蛋白工艺化生产的可行性.方法:①在细胞培养板中,分别以含10%小牛血清和10%胎牛血清的Grace培养液培养Sf9细胞,每天进行细胞计数和XTT比色分析,并绘制生长曲线.②重组杆状病毒感染两种血清培养下的Sf9细胞,培养72 h后收集细胞,ELISA检测细胞内重组蛋白的表达量.结果:胎牛血清培养液中Sf9细胞生长曲线好于小牛血清培养液中生长的Sf9细胞,但两种血清培养液中Sf9细胞增殖活力、重组蛋白的表达并无显著差别(P>0.05).结论:胎牛血清能更好的促进Sf9细胞生长,小牛血清也可用于Sf9细胞的培养以及重组蛋白生产.
