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卵巢癌相关基因HFA在杆状病毒表达系统的表达与鉴定
目的:使卵巢癌相关基因HFA在杆状病毒表达系统中获得表达.方法:将卵巢癌相关基因HE4克隆到pMagic-his-HE4中,通过转化E.coli DH10B筛选克隆,阳性克隆通过接合转移的方式与杆状病毒框架质粒体外重组,构建Bac-phes-HE4杆状病毒表达载体,后者经Lipofectamine 2000介导转染Sf 9细胞,获取重组病毒,扩增病毒并感染Sf 9细胞进行表达,SDS-PAGE、Westernblot分析鉴定表达蛋白.结果:经HE4抗体、6×His单抗鉴定,成功通过杆状病毒表达系统获得重组卵巢癌相关基因HE4.结论:卵巢癌相关基因HFA通过接合转移的方法在杆状病毒表达系统中成功表达.
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人卵巢癌相关候选基因HE4(WFDC2)的转录调控主要由Sp1与位于-71和-48的Egr-1位点结合所介导
目的阐明HE4基因转录调控机制的细节.方法1.用半定量RT-PCR的方法评估HE4基因在肿瘤细胞株中的表达情况;2.以荧光素酶报告基因载体为基础,对HE4基因的上游顺序构建了3'、5'缺失突变和一系列连接体扫描突变;3.通过瞬时转染/体外双荧光素酶报告系统对这些重组质粒中插入片段进行启动子活性的分析;4.针对蛋白和关键顺式区域的结合的特异性和能力,开展泳动滞后和抗体介导的超迁移分析.结果通过对(-1860/+29)的HE4基因上游片段及其剪切体的分析,将HE4基因小启动子确定为-107/+15的DNA片段.通过对连接体扫描突变体的分析,将关键的顺式作用元件确定在W45(-71/-48)片段,生物信息学提示该区存在两个Egr-1位点.通过用已知的反式作用因子与报告基因质粒分别进行共转染,提示Sp1是为有效的反式作用因子,而不是Egr-1.通过泳动滞后和抗体介导的超迁移实验,证实Sp1确实是参与作用的转录因子.结论HE4基因的转录活性主要是由转录因子Sp1与位于(-71/-48)区域的两个Egr-1位点结合所介导的.
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骨桥蛋白及人附睾蛋白4基因在上皮性卵巢癌中的表达及临床价值
目的研 究卵巢癌中骨桥蛋白(OPN)与人附睾蛋白4(HE4)表达与临床病理因素之间的关系,并分析其对患者预后的影响.方法 选择本院2015年1月至2016年7月收治的21例卵巢上皮交界性肿瘤患者、16例卵巢上皮性良性肿瘤患者以及55例上皮性卵巢癌患者作为本次研究对象,应用免疫组织化学S-P法分别对其肿瘤组织中的OPN与HE4蛋白的表达情况进行检测与分析,并观察蛋白表达与临床病理因素之间的相关性及预后影响.结果 上皮性卵巢癌OPN、HE4的阳性表达率明显高于卵巢上皮交界性肿瘤及卵巢上皮性良性肿瘤(P＜0.05),OPN、HE4的阳性表达率随着临床分期与病理分级的增高而增高,Ⅲ期、Ⅳ期明显高于Ⅰ期(P＜0.05);病理分级3级明显高于1级(P＜0.05);淋巴结转移者显著高于无淋巴结转移者(P＜0.05).结论 OPN、HE4基因蛋白高表达与上皮性卵巢癌浸润、侵袭与淋巴结转移存在明显相关性,且对患者预后有促进作用.
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卵巢癌肿瘤标记物HE4基因的分子克隆与蛋白表达
目的构建HE4基因及蛋白表达系统,用于卵巢癌的早期诊断.方法提取卵巢癌细胞H08910的总RNA,利用RT-PCR技术扩增HE4基因,然后将该片段进行T-A克隆并测序鉴定,纯化回收后亚克隆于原核表达载体PGEX-4T-1中,然后提取质粒,酶切鉴定,后经IPTG诱导,原核表达重组子在TOP10宿主菌进行表达,并进行SDS-PAGE、Western Blot分析与鉴定.结果应用RT-PCR技术,从卵巢癌HO8910的总RNA中扩增到一条大小约为400 bp的片段,经T-A克隆与测序鉴定,证实此片段为HE4基因,将PGEX-4T-1重组子转化入宿主菌,用IPTG诱导菌体表达HE4重组蛋白,经SDS-PAGE电泳和Western Blot鉴定证实,在相对分子量约39 000处可见明显的特异性的高表达条带.结论已成功克隆HE4基因,并经IPTG诱导在TOP10宿主菌中表达了相应的蛋白,为进一步制备卵巢癌的早期诊断试剂奠定基础.
