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O型口蹄疫病毒VP1基因在昆虫细胞/杆状病毒中的表达
目的口蹄疫病毒的VP1蛋白是诱导中和抗体及激发保护性免疫应答的主要抗原蛋白,利用Bac-toBac杆状病毒表达系统表达VP1基因,为建立O型口蹄疫抗体血清学诊断方法奠定基础.方法将O型口蹄疫病毒VP1基因插入pFastBacHIa载体,构建重组质粒pFast BacHIa-VP1.将该重组质粒转化DH10Bac感受态细胞,VP1基因与Bacmid发生特异性位点转座.经PCR鉴定证实VP1基因正确地插入到病毒基因组多角体蛋白基因启动子下游,提取阳性质粒转染Sf9昆虫细胞.结果 SDS-PAGE电泳和Western blot检测结果表明VP1基因成功地在Sf9昆虫细胞中进行了表达,蛋白分子量为26.4kDa.结论 VP1基因在Bac-to-Bac系统中的成功表达为口蹄疫病毒VP1蛋白的抗原性、免疫原性以及免疫抗体水平检测研究奠定了基础.
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iNOS基因和iNOS-VP1融合基因真核表达载体的构建及初步表达
目的 构建pcDNA3.1介导的诱导性一氧化氮合成酶(iNOS)的基因表达载体和pcDNA3.1介导的iNOS与柯萨奇病毒B组3型(CVB3)结构蛋白VP1融和基因的表达载体.方法 应用PCR扩增和DNA重组技术构建pcDNA3.1-iNOS和pcDNA3.1-iNOS-VP1表达载体;应用真核细胞转染技术及间接免疫荧光技术进行所构建的真核表达载体的初步表达和鉴定.结果 经PCR扩增技术用特异引物从质粒pKSiNOS分离编码iNOS开放阅读框架的cDNA,TA克隆于pMD19-T载体,根据设计引物时加入的酶切位点将插入片断亚克隆于表达载体pcDNA3.1;经PCR扩增技术用特异引物从质粒pCR2.1-VP1分离编码CVB3VP1结构蛋白的cDNA,TA克隆于pMD19-T载体,根据设计引物时加入的酶切位点将VP1亚克隆于iNOS的表达载体pcDNA3.1-iNOS,从而构建含有iNOS和VP1融合基因的真核表达载体.限制性内切酶分析、PCR鉴定和测序证实重组体pcDNA3.1-iNOS和pcDNA3.1-iNOS-VP1插入片断的大小和方向正确且开放阅读框架的读码框不变;重组质粒pcDNA3.1-iNOS和pcDNA3.1-iNOS-VP1在HeLa细胞中均有表达,但表达效率较低.结论 获得含iNOS基因和iNOS-VP1融合基因的真核表达载体,并将重组质粒进行了初步表达,为体外iNOS抗CVB3作用的研究奠定了物质基础.
关键词： 诱导型一氧化氮合成酶 结构蛋白VP1 真核表达载体 表达 -
肠道病毒71型VP1抗原表位多肽疫苗的实验研究
目的 根据贵州省手足口病患儿肠道病毒71型(EV71)分离株的VP1结构蛋白序列研制多肽疫苗并研究其对小鼠的免疫保护作用.方法 2013年3月1日至2015年12月31日从贵州省手足口病患儿的咽拭子样本中分离到17株EV71毒株,其VP1氨基酸序列一致(共297个氨基酸),据此设计并合成多肽片段(除后一段为27个氨基酸外,其余均为20个氨基酸);用感染EV71的手足口病病愈患儿的阳性血清,通过间接ELISA法筛选出免疫原性较好的多肽片段,制成多肽疫苗;用多肽疫苗免疫ICR健康雌鼠,并设未免疫的对照(Con);将雌鼠的子代小鼠随机分为注射和不注射EV71病毒颗粒的2个亚组;注射病毒2d后处死所有小鼠,分别取小鼠的骨骼肌、小肠和脑组织,通过RT-PCR检测病毒感染情况,同时HE染色后在显微镜下观察病理改变.结果 共设计并合成19段含交叉序列的多肽片段,从中筛选出3段免疫原性较好的(P2:VSRALTHALPAPTGQNTQVS;P4:ALQAAEIGASSNASDESMIE;P8:YANWDIDITGYAQMRRKVEL),制成多肽疫苗并免疫雌鼠,取雌鼠的子代小鼠进行后续试验.RT-PCR结果显示,各感染病毒亚组的骨骼肌、小肠和脑组织中均能检测到EV71病毒,而未感染病毒亚组均检测不到;病理结果显示,未接种多肽疫苗母鼠的子代小鼠在感染EV71病毒后,骨骼肌、小肠和脑组织均出现明显的炎性改变;接种多肽疫苗母鼠的子代小鼠骨骼肌、小肠和脑组织的炎性改变明显减轻,3种多肽疫苗对EV71所致炎症的改善作用无明显差异;接种多肽疫苗母鼠的未注射病毒亚组子代小鼠骨骼肌、小肠和脑组织中均未检测到EV71病毒,也未观察到明显的炎性改变.结论 本研究成功制备VP1抗原表位多肽疫苗并在动物实验中证实了其有效性和安全性,可为今后相关疫苗的研制提供方法学借鉴.
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EV71结构蛋白 VP1对核因子κB 活化的影响
目的：研究肠道病毒71型（EV71）结构蛋白 VP1对核因子κB（NF-κB）活化的影响。方法将 EV71结构蛋白 VP1 cDNA 连入表达载体 pcDNATM3.1/ myc-His（-）A，转入大肠杆菌 TOP10，将酶切和 PCR 鉴定阳性的重组质粒转染至肺腺癌上皮细胞，并诱导表达，同时设立对照组，凝胶迁移试验检测各组 NF-κB 的活化程度。结果 EV71 VP1重组质粒转染肺腺癌上皮细胞不会引起 NF-κB 表达量的明显变化。结论质粒 pcDNATM 3.1/myc-His-VP1转染 A549细胞成功表达后，细胞内 NF-κB 的表达量并无明显变化，这可能与多种细胞因子参与 NF-κB 的激活通路有关。
