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人端粒酶逆转录酶启动子调控腺病毒介导的胸苷激酶基因治疗膀胱癌的实验研究
目的观察人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子调控腺病毒介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/丙氧鸟苷(HSV-tk/GCV)自杀基因系统体外对人膀胱癌的选择性杀伤效应. 方法利用不同感染复数(MOI)的重组腺病毒携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因感染膀胱癌细胞253J和人成纤维细胞MRC-5,荧光显微镜下观察其感染效率.利用携带不同启动子的重组腺病毒Ad-hTERT-HSV/tk以及Ad-CMV-HSV/tk感染253J和MRC-5细胞,加入不同浓度GCV,MTT法观察受染细胞的存活率. 结果重组腺病毒Ad-hTERT-EGFP能特异性转染253J细胞,其转染效率随重组病毒的MOI增加而升高(P<0.01),MOI为1时转染率为8.3%,MOI为1000时转染率达100.0%;应用GCV 处理后,Ad-CMV-HSV/tk对253J和MRC-5细胞均有杀伤作用,而Ad-hTERT-HSV/tk只杀伤253J细胞(P<0.001),随着MOI和GCV浓度增加,253J细胞存活率明显降低(P<0.01),MOI为1、GCV浓度为1μmol/L时存活率为95.4%,MOI为100、GCV浓度为1000μmol/L时存活率仅为6.1%,并有旁观者效应. 结论重组腺病毒携带EGFP报告基因可准确、简便地确定转染效率,hTERT启动子调控的重组腺病毒介导的HSV-tk/GCV自杀基因系统对人膀胱癌细胞有靶向杀伤作用.
关键词： 膀胱肿瘤 癌 腺病毒 人端粒酶逆转录酶启动子 单纯疱疹病毒胸苷激酶基因 -
人端粒酶逆转录酶启动子调控的携带胞嘧啶脱氨酶基因腺病毒载体的构建
目的 构建由人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)启动子驱动的含胞嘧啶脱氨酶自杀基因(cytosine deaminase gene,CD)的复制缺陷型腺病毒载体.方法 首先构建带有hTERT启动子及CD基因的穿梭质粒pSU-TP-CD,然后与腺病毒骨架质粒pBHGE3共转染到293细胞,通过细胞内同源重组法获得复制缺陷性病毒.结果 经PCR鉴定证明,成功构建了含有hTERT启动子及CD基因的重组腺病毒.结论 成功构建了携带hTERT启动子和CD基因的复制缺陷型腺病毒Ad-hTERTp-CD,为下一步进行基因治疗研究奠定了基础.
关键词： 人端粒酶逆转录酶启动子 胞嘧啶脱氨酶基因 腺病毒载体 -
人端粒酶逆转录酶启动子调控的胞嘧啶脱氨酶基因对宫颈癌细胞株的选择性杀伤作用研究
目的 探讨由人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)启动子驱动的含胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase,CD)基因的复制缺陷型腺病毒,对宫颈癌细胞的选择性杀伤作用.方法 将自行构建复制的缺陷型腺病毒载体Ad-hTERTp-CD,由端粒酶逆转录酶启动子调控的携带胞嘧啶脱氨酶基因的重组腺病毒,分别感染人宫颈癌细胞株Hela(研究组)及人胚肺成纤维细胞(human embryo lung fibroblast cells, hELF)(对照组),采用不同滴度重组腺病毒及不同浓度氟胞嘧啶(5-flurocytosine,5-FC)作用于Hela细胞(研究组)后,通过MTT法,检测研究组和对照组受染细胞的存活率,观察分析腺病毒载体对两种细胞的杀伤作用.结果 MTT法检测到研究组细胞存活率随病毒滴度和氟胞嘧啶浓度的增加,不断降低;而同样处理,对人胚肺成纤维细胞(对照组)也有部分杀伤作用,但远较Hela细胞(研究组)弱,两组比较,差异有显著意义(P<0.01).结论 本实验构建的复制缺陷型腺病毒Ad-hTERTp-CD对Hela细胞具有靶向杀伤作用.
关键词： 人端粒酶逆转录酶启动子 自杀基因 胞嘧啶脱氨酶基因 腺病毒载体 -
人端粒酶逆转录酶启动子在裸鼠中增强人喉癌对基因放射治疗的敏感性
目的 探索人端粒酶逆转录酶启动子(hTERTp)介导自杀基因辣根过氧化酶(HRP)-吲哚乙酸(IAA)系统联合射线,对相同来源而放射敏感性不同的人喉癌移植瘤模型的治疗作用.方法 建立相同来源而放射敏感性不同的人喉癌(Hep-2和Hep-2R细胞)移植瘤模型,并分为联合治疗组(A组和AR组)、基因治疗组(B组和BR组)、单纯放射组(C组和CR组)和对照组(D组和DR组).瘤内注射脂质体包裹的质粒phTERTp-HRP,腹腔内注射IAA从并联合放疗30 Gy,观察对移植瘤生长的抑制作用.应用原位末端转移酶标记技术(TUNEL)检测肿瘤细胞的凋亡情况;应用AP法检测瘤内HRP蛋白的表达.结果 裸鼠移植瘤生长以联合治疗组慢,以对照组快.A组的肿瘤抑制率为54.8%,B组为10.0%,C组为31.9%,AR组为52.7%,BR组为24.8%,CR组为17.0%.A组和AR组可见大量肿瘤细胞坏死和凋亡,凋亡指数分别为16.6%±1.3%和17.6%±1.3%,高于其他组(P<0.05).B组的HRP蛋白表达率(21.9%±5.7%)低于BR组和(33.3%±8.9%),辐射诱导后,A组和AR组的HRP蛋白表达率分别增加2.1和1.6倍(P<0.05).结论 在不同放射敏感性的喉癌移植瘤模型中,hTERTp能被射线诱导,并根据瘤内端粒酶活性增强HRP基因的表达.hTERTp·HRP-IAA系统通过诱导肿瘤细胞凋亡和引起细胞坏死,抑制裸鼠移植瘤生长,并与射线协同作用,起到放射增敏作用.
关键词： 人端粒酶逆转录酶启动子 基因放疗 喉肿瘤 裸鼠 -
靶向性启动子携带报告基因NIS介导提高胶质瘤摄碘能力
目的 在细胞实验中探讨靶向性人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子携带人类钠碘转运体(hNIS)基因能否提高胶质瘤的摄碘能力.方法 检测在hTERT启动子引导下表达hNIS基因的腺病毒,使用该腺病毒转染U87和U251细胞系,然后使用Υ记数仪检测转染后细胞的摄碘能力.结果 实验组肿瘤细胞在转染Ad-hTERT-hNIS后,相对于对照组细胞摄碘率提高约30～40倍.结论 实验证明hTERT启动子能引导胶质瘤细胞系表现出肿瘤特异性的碘摄取.
关键词： 胶质瘤 NIS基因 人端粒酶逆转录酶启动子 放射性碘 -
人端粒酶逆转录酶启动子调控腺病毒介导胸苷激酶基因治疗人膀胱癌的动物实验研究
目的:探讨带有人端粒酶逆转录酶(hTERT)动子驱动单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(HSV-tk)基因的重组腺病毒Ad-hTERT-HSV-tk结合无毒的环氧鸟苷(GCV)对人膀胱癌的治疗作用.方法:建立人膀胱癌细胞株253J BALB/C裸小鼠移植瘤模型,采用Ad-hTERT-HSV-tk裸鼠尾静脉注射,腹腔注射GCV治疗并观察结果.通过常规病理切片观察肿瘤破坏情况及安全性;通过TUNEL染色进一步观察肿瘤的凋亡情况,免疫组化法测定增值细胞核抗原(PCNA).结果:Ad-hTERT-HSV-tk/GCV治疗组,显示出明显的肿瘤抑制作用,其肿瘤体积、重量显著低于各对照组(P＜0.05),抑瘤率明显.Ad-hTERT-HSV-tk/GCV治疗组凋亡指数高于其它各组,而增殖指数却明显低于其它各组.结论:Ad-hTERT-HSV-tk/GCV系统对裸鼠移植瘤的生长有明显抑制作用,可以靶向性转入人膀胱癌细胞,治疗效果显著.
关键词： 膀胱肿瘤 单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶基因 腺病毒 人端粒酶逆转录酶启动子 -
腺病毒介导的HSV-tk/GCV自杀基因系统靶向性治疗前列腺癌的实验研究
日曲:观察腺病毒介导单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/丙氧鸟苷(HSV-tk/GCV)自杀基因系统在人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子调控下对人前列腺癌细胞的靶向性体外杀伤效应.方法:利用不同感染复数(MOI)的重组腺病毒携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因感染前列腺癌细胞LNCaP和人成纤维细胞MRC-5, 荧光显微镜下观察其感染效率;利用携带不同启动子的重组腺病毒Ad-hTERT-HSV/TK以及Ad-CMV-HSV/TK感染LNCaP和MRC-5细胞.加入不同浓度GCV,MTY法观察受转染细胞的存活率.结果:重组腺病毒Ad-hTERT-EGFP能特异地转染LNCaP, 其转染效率随重组病毒的MOI增加而升高(P<0.01),MOI为1时转染率为8.3%,MOI为1000时转染率达100%;应用GCV处理后,Ad-CMV-HSV/TK对LNCaP和MRC-5细胞均有杀伤作用,而Ad-hTERTp-HSWTK只杀伤LNCaP(P<0.001),随着MOI和GCV浓度的增加,LNCaP细胞存活率明显降低(P>0.01),MOI为1和GCV浓度为1μmol/L时存活率为95.4%,MOI为100和GCV浓度为1000μmol/L时存活率仅为6.1%,并有旁观者效应.结论:重组腺病毒携带EGFP报告基因可准确、简便地确定转染效率;hTERT启动子调控的重组腺病毒介导的HSV-tk/GCV自杀基因系统对人前列腺癌细胞有靶向杀伤作用.
关键词： 前列腺癌 重组腺病毒 自杀基因 人端粒酶逆转录酶启动子 -
hTERT启动子调控腺病毒介导的CD基因治疗卵巢癌的实验研究
目的:构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子驱动的含胞嘧啶脱氨酶(CD)基因的复制缺陷型腺病毒载体,使CD基因只能在端粒酶阳性的细胞表达.方法:采用细胞内同源重组法构建出hTERT启动子调控的携带CD基因的复制缺陷型腺病毒Ad-hTERTp-CD,经PCR鉴定正确后进行扩增、纯化和滴度测定.分别将腺病毒感染人卵巢癌细胞株SKOV3及人胚肺成纤维细胞,MTT法检测受染细胞的存活率.结果:构建的重组腺病毒中带有hTERT启动子及CD基因.用不同滴度的重组腺病毒以及不同浓度的5-FC作用于SKOV3细胞后,MTT法检测到细胞的存活率随着病毒滴度和5-FC浓度的增加而不断降低;而同样的处理对人胚肺成纤维细胞的也有部分杀伤作用,但远较SKOV3细胞弱,差异有统计学意义(P＜0.01).结论:本实验构建的由hTERT启动子调控的携带CD基因的复制缺陷型腺病毒Ad-hTERTp-CD对SKOV3细胞具有靶向杀伤的能力.
关键词： 基因治疗 人端粒酶逆转录酶启动子 自杀基因 胞嘧啶脱氨酶基因 腺病毒载体 -
hTERT启动表达VacA基因的重组杆状病毒载体的构建
目的 构建人端粒酶逆转录酶启动子(hTERT)调控的、携带幽门螺杆菌细胞空泡毒素A(Vacuolatingcytotoxin A,VacA)基因的选择性表达重组杆状病毒.方法 应用酶切、连接方法将hTERT连接于杆状病毒穿梭质粒pFastBacTM DUAL载体P10启动子序列之后,和SV40分别调控目的基因VacA的表达和终止;将重组穿梭质粒电转入DH10BacTME.coli感受态细胞,经转座重组获得重组杆粒Bacmid-VacA.利用脂质体Cellfectin(R)将重组杆粒转染Sf9昆虫细胞,包装重组杆状病毒.结果 应用PCR验证、双酶切分析、序列测定等方法验证重组质粒基因片段连接正确无突变,通过转座重组获得携带有VacA基因片段的重组杆粒.结论 携带VacA基因的选择性复制重组杆粒成功构建.
关键词： 杆状病毒 空泡毒素A 人端粒酶逆转录酶启动子 -
hTERT启动子的克隆及在胃癌细胞中的转录活性研究
目的:克隆人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)核心启动子,研究hTERT启动子在人胃癌细胞SGC7901和正常人成纤维细胞HLF中的转录活性.方法:以Hela细胞的基因组DNA为模板,PCR扩增hTERT核心启动子片段,将其克隆入荧光素酶报告基因质粒pGL3-Basic构建hTERT-pGL3Basic表达载体.将该载体用脂质体转染法转染SGC7901和HLF细胞,检测hTERT启动子在这两种细胞中的转录活性.结果:成功克隆hTERT核心启动子;双酶切和PCR鉴定均显示hTERT-pGL3Basic表达载体构建成功;荧光素酶活性检测显示hTERT启动子在SGC7901细胞中的转录活性为阳性对照的21.5%,而在HLF细胞中无活性.结论:hTERT启动子具有肿瘤特异性,可以用于肿瘤的靶向基因治疗.
关键词： 人端粒酶逆转录酶启动子 克隆 靶向基因治疗 胃癌 -
人端粒酶逆转录酶启动子介导的E1A和IL-24表达及其对肝癌细胞生长的抑制作用
目的 构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子介导的E1A和IL-24双基因靶向腺病毒载体,获得Ad-h-E1A-IL-24靶向重组病毒子,并探索其体外抑瘤作用.方法 运用 PCR扩增MCF-7乳腺癌细胞的DNA,Xba Ⅰ和HindⅢ酶切获得280 hp hTERT启动子,插入空载体构建成pTrack-hTERT;运用PCR及HindⅢ和XhoⅠ酶切获得E1A,与pTrack-hTERT构成pAdTrack-hTERT-E1A；运用PCR及Not Ⅰ和SalⅠ酶切获得IL-24,插入pTrack-PP-1RES；XbaⅠ和XhoⅠ酶切获得hTERT-E1A,与pTrack-PP-IL-24-IRES形成pTrack-hTERT-E1 A-PP-IL-24-IRES,同源重组、包装和扩增获得Ad-h-E1 A-IL-24重组靶向病毒子.用25 MOI重组靶向腺病毒感染SMMC-7721肝癌细胞,MTT法测定Ad-h-E1 A-IL-24的细胞生长抑制作用.结果 成功构建pTrack-hTERT-E1 A-PP-IL-24-IRES,并获得Ad-h-E1A-IL-24重组病毒于.与非靶向双基因比较,Ad-h-E1A-IL-24组可明显抑制肿瘤细胞生长(P ＜0.05或0.01).结论 Ad-h-E1 A-IL-24靶向腺病毒载体的体外抑瘤作用优于非靶向双基因载体.
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hTERT启动子驱动的HSV-TK基因重组腺病毒载体的构建和制备
目的 构建人端粒酶逆转录酶启动子驱动的HSV-TK基因重组腺病毒的真核表达载体,为进一步研究其在体内外实验提供依据.方法 PDC312-TP质粒和PSUCMV-TK质粒经EcoR I,Sal I酶切连接构建PDC312-TP-TK,将质粒PDC312-TP-TK与含有5型腺病毒右臂的质粒Pbhge3通过Lipofectamine 2000共转染至293细胞,经同源重组产生重组腺病毒PSG-TP-TK,PSG-TP-TK在293细胞中大量扩增并通过氯化铯密度梯度离心法纯化,测其滴度.结果 质粒PDC312-TP-TK经酶切鉴定正确,扩增得到的PSG-TP-TK经PCR扩增证实为hTERT启动子驱动的HSV-TK重组腺病毒,腺病毒滴度为1.9×1010pfu/ml.结论 该实验为重组腺病毒PSG-TP-TK用于肿瘤的基因治疗打下了基础.
关键词： 人端粒酶逆转录酶启动子 单纯疱疹病毒胸苷激酶基因 腺病毒 -
腺病毒介导的HSV-tk/GCV系统在hTERT启动子调控下治疗人膀胱癌的实验研究
目的 观察人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子调控的腺病毒介导单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因/丙氧鸟苷(GCV)系统在体外及荷瘤裸鼠体内对人膀胱癌的治疗作用.方法 利用hTERT启动子及小鼠巨细胞病毒(CMV)启动子调控的携带HSV-tk基因的重组腺病毒(Ad-hTERT-HSV/tk与Ad-CMV-HSV/tk)分别感染人膀胱癌细胞253J和人正常肺成纤维细胞MRC-5,加入GCV,MTT法观察受染细胞的存活率.建立人膀胱癌裸鼠移植瘤模型,随机分为4组,A组(Ad-hTERT-HSV/tk+GCV组)、B组(Ad-hTERT-HSV/tk+PBS组)、C组(PBS+GCV组)和D组(PBS对照组),观察各组肿瘤生长状况、重要脏器病理变化及裸鼠存活情况.结果 体外实验表明,应用GCV处理后,Ad-CMV-HSV/tk对253J和MRC-5细胞均有杀伤作用,而Ad-hTERT-HSV/tk只对膀胱癌细胞253J具有杀伤作用.动物实验显示,A组移植瘤的体积和瘤重低于其他3组(P<0.01).A组裸鼠平均存活期长于其他3组(P<0.01).结论 hTERT启动子调控的重组腺病毒介导HSV-tk/GCV系统是一种安全、有效且靶向性高的基因疗法.
关键词： 膀胱肿瘤 基因治疗 人端粒酶逆转录酶启动子 单纯疱疹病毒胸苷激酶基因 -
人端粒酶逆转录酶启动子调控的真核荧光表达载体的构建与表达
目的:克隆人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子,构建真核表达载体pEGFP-C3-hTERTp.方法:PCR方法扩增出hTERTp,依次克隆至pGEM-T Easy载体和重组载体pEGFP-C3上.经酶切和测序鉴定后,重组质粒pEGFP-C3-hTERTp转染人胚肾293A细胞,并在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况.结果:成功扩增出276 bp的hTERTp,测序结果与GenBank中hTERT启动子DNA序列完全一致.重组载体pEGFP-C3-hTERTp转染293A细胞能观察到荧光表达.结论:成功构建了hTERT启动子调控的真核绿色荧光表达载体pEGFP-C3-hTERTp,其能够在人胚肾293A细胞中表达.
关键词： 人端粒酶逆转录酶启动子 真核荧光表达载体 构建 表达 -
hTERT启动子调控的融合自杀基因CD:UPRT载体的构建及其应用
目的 构建hTERT启动子调控的融合自杀基因CD:UPRT表达载体,研究其对人胃癌细胞SGC7901的体外靶向性杀伤作用.方法 PCR扩增hTERT核心启动子片段,克隆入荧光素酶报告基因质粒pGL3-Basic,检测hTERT启动子在人胃癌细胞SGC7901和人成纤维细胞HLF中的转录活性.构建hTERT启动子调控的CD:UPRT基因表达载体hTERT-CD:UPRT,将其和CMV启动子调控的CD:UPRT基因表达载体pcDNA 3.1-CD:UPI汀用脂质体转染法分别转染入SGC7901和HLF细胞,筛选稳定表达细胞系,用RT-PCR和Western blot方法检测CD基因的表达,用MTT法检测5-FC对转染细胞的杀伤作用.结果 成功克隆hTERT核心启动子;荧光素酶活性检测显示,hTERT启动子在SGC7901细胞中的转录活性为阳性对照的(21.50±2.15)%,而在HLF细胞中仅有背景活性.成功构建hTERT启动子调控的CD:UPRT基因表达裁体,转染pcDNA 3.1-CD:UPRT的SGC7901和HLF细胞以及转粢hTERT-CD:UPRT的SGC7901细胞在mRNA和蛋白质水平均可检测到CD基因的表达,且对5-FC敏感;而转染hTERT-CD:UPRT的HLF细胞未检测到CD基因的表达,对5-FC不敏感.结论 构建的hTERT启动子调控的融合自杀基因系统CD:UPRT/5-FC能在体外靶向性杀伤SGC7901细胞.
关键词： 人端粒酶逆转录酶启动子 胞嘧啶脱氨酶 尿嘧啶磷酸核糖转移酶 胃癌 靶向基因治疗 -
人端粒酶逆转录酶基因启动子介导重组Caspase-3治疗人肺腺癌的研究
目的 探讨使重组Caspase-3分子选择性诱导人肺腺癌细胞凋亡从而杀伤肿瘤细胞的可行性.方法 构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因启动子调控下的重组Caspase-3分子,通过报告基因分析、Caspase-3酶活性分析、流式细胞分析、MTT方法和动物实验来研究其在肿瘤细胞中选择性诱导凋亡的作用.结果 通过Caspase-3酶活性分析,发现phTERT-Rev-Caspas-3在人肺腺癌细胞A549中能够诱导Caspase-3的活性表达,流式细胞分析和MTT方法提示其具有明显的诱导A549细胞凋亡、抑制增殖的作用;动物实验显示其能够有效地抑制肺癌裸鼠移植瘤的生长.结论 phTERT-Rev-Caspase-3是一种有效的选择性诱导人肺腺癌细胞凋亡的分子.
关键词： 肺腺癌 细胞凋亡 人端粒酶逆转录酶启动子 -
人端粒酶逆转录酶启动子转录活性的磁共振成像研究
目的 探索磁共振成像技术检测人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)启动子靶向转录活性的可行性.方法 构建慢病毒Lenti-hTERT-Fth-flag-Puro和对照Lenti-CMV-Fth-flag-Puro载体,将上述载体分别转染端粒酶阳性的肺腺癌(A549)和端粒酶阴性的原代人牙周膜成纤维(human periodontal ligament fibroblasts,HPDLFs)细胞.进行免疫荧光染色和Western blot检测细胞Fth-flag表达情况,采用普鲁氏蓝铁染色检测细胞摄铁量,MR扫描观察细胞T2* WI信号和T2*值改变.结果 A549细胞转染Lenti-hTERT-Fth-flag-Puro载体后,免疫荧光染色和Western blot检测结果显示转染细胞表达Fth-flag蛋白,未转染细胞不表达Fth-flag蛋白,普鲁氏蓝铁染色示转染细胞摄铁量较未转染细胞显著增加,MR扫描显示转染细胞T2* WI信号(1 340.86±49.21)和T2*值(12.10 ±0.92)较未转染细胞(2 049.08±87.58),(21.44±1.15)显著降低(P＜0.05)；HPDLFs细胞转染Lenti-hTERT-Fth-flag-Puro载体后,细胞无Fthflag蛋白表达,细胞摄铁量较未转染细胞无变化,T2* WI信号(2 225.42±73.43)和T2*值(24.01 ±1.13)较未转染细胞T2* WI信号(2 148.48 ±54.74)和T2*值(23.39±1.72)无显著差异(P＞0.05).而转染对照Lenti-CMV-Fth-flag-Puro慢病毒载体后,A549和HPDLFs细胞均表达Fth-flag蛋白,转染细胞摄铁量较未转染细胞均显著增加,转染细胞T2* WI信号[A549:(1 137.38 ±60.59),HPDLFs:(1 299.16±53.42)]和T2*值[A549:(9.61±1.17),HPDLFs:(11.54±0.74)]均比未转染细胞显著下降(P＜0.05).结论 MR铁蛋白报告基因成像技术可用于检测hTERT启动子转录活性,构建的慢病毒载体有望为恶性肿瘤的靶向诊断提供一种新的方法.
关键词： 磁共振成像 人端粒酶逆转录酶启动子 铁蛋白 报告基因 -
AdTERT-TRAIL对腺样囊性癌细胞株SACC-83靶向转基因作用的研究
目的 探讨人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子调控TRAIL基因在端粒酶阳性的涎腺肿瘤细胞SACC-83中靶向表达的作用.方法 通过同源重组构建腺病毒载体AdTERT-TRAIL,并转染SACC-83细胞和端粒酶阴性的HEL细胞,通过RT-PCR检测TRAIL基因表达,MTT法检测TRAIL基因表达对细胞增殖的影响,流式细胞仪检测细胞凋亡率.结果 转染AdTERT-TRAIL后,TRAIL基因在SACC-83细胞中明显表达,对该肿瘤细胞的增殖有明显的抑制作用,而且诱导细胞凋亡比率增加;而在HEL细胞中未能诱导TRAIL基因表达,对该细胞的增殖没有影响,也没有诱导明显的细胞凋亡.结论 成功构建腺病毒载体AdTERT-TRAIL,对涎腺肿瘤细胞具有靶向转基因作用.
关键词： 人端粒酶逆转录酶启动子 腺病毒 涎腺肿瘤 -
hTERT启动子调控的CD基因对卵巢癌细胞株的选择性杀伤作用研究
目的 探讨由人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子驱动的含胞嘧啶脱氨酶(CD)基因的复制缺陷型腺病毒对卵巢癌细胞的选择性杀伤作用.方法 将自行构建的由hTERT启动子调控的携带CD基因的重组腺病毒分别感染人卵巢癌细胞株SKOV3及人胚肺成纤维细胞,通过MTT法检测受染细胞的存活率,观察分析腺病毒载体对细胞的杀伤作用.结果 用不同滴度的重组腺病毒以及不同浓度的5-FC作用于SKOV3细胞后,MTT法检测到细胞的存活率随着病毒滴度和5-FC浓度的增加而不断降低;而同样的处理对人胚肺成纤维细胞的也有部分杀伤作用,但远较SKOV3细胞弱,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 本实验构建的复制缺陷型腺病毒Ad-hTERTp-CD对SKOV3细胞具有靶向杀伤的能力.
关键词： 人端粒酶逆转录酶启动子 自杀基因 胞嘧啶脱氨酶基因 腺病毒载体 -
腺病毒介导HSV-TK/GCV自杀基因系统靶向性治疗前列腺癌实验研究
目的 观察腺病毒介导单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/N氧鸟苷(HSV-TK/GCV)自杀基因系统在人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子调控下对人前列腺癌细胞的靶向性体外杀伤效应.方法 利用不同感染复数(MOI)的重组腺病毒携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因感染前列腺癌细胞LNCaP和人成纤维细胞MRC-5,荧光显微镜下观察其感染效率;利用携带不同启动子的重组腺病毒Ad-hTERT-HSV/TK以及Ad-CMV-HSV/TK感染LNCaP和MRC-5细胞,加入不同浓度GCV,MTT法观察受转染细胞的存活率.结果 重组腺病毒Ad-hTERT-EGFP能特异地转染LNCaP,其转染效率随重组病毒的MOI增加而升高(P<0.01),MOI为1时转染率为8.3%,MOI为1 000时转染率达100%;应用GCV处理后,Ad-CMV-HSV/TK对LNCaP和MRC-5细胞均有杀伤作用,而Ad-hTERTp-HSV/TK只杀伤LNCaP(P<0.001),随着MOI和GCV浓度的增加,LNCaP细胞存活率明显降低(P<0.01),MOI为1和GCV浓度为1μmol/L时存活率为95.4%,MOI为100和GCV浓度为1 000 μmol/L时存活率仅为6.1%,并有旁观者效应.结论 重组腺病毒携带EGFP报告基因可准确、简便地确定转染效率;hTERT启动子调控的重组腺病毒介导的HSV-TK/GCV自杀基因系统对人前列腺癌细胞有靶向杀伤作用.
关键词： 前列腺癌 重组腺病毒 自杀基因 人端粒酶逆转录酶启动子
