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辐射敏感性启动子调控CD基因表达联合125I照射对膀肤癌EJ细胞的杀伤作用
以脂质体介导的辐射敏感性基因联合胞嘧啶脱氨酶(cytosine deantinase,CD)基因转染膀胱癌EJ细胞,研究放射性核素125 I照射后5-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine,5-FC)对转染膀胧癌EJ细胞的杀伤作用.人工合成辐射敏感性启动子E8,将启动子克隆至质粒pCD2的CD基因上游,构建以E8为启动子、CD基因为目的基因的新质粒,并采用DNA测序法测定E8和CD基因的序列;脂质体Lipofectamine2000介导pE8-CD转染膀胧癌EJ细胞,用[3]I照射(吸收剂量为2舜)后,蛋白质免疫印迹分析(Western blot)测定CD蛋白表达;在转染EJ细胞中分别加人不同剂量125 I勺和5-FC,四哇盐比色法(MTT法)测定各组细胞存活率,并以未经125 I勺照射组、未加5-FC组和5-氟尿啼吮(5-FU)组(阳性对照组)进行对照.DNA测序显示构建的pE8-CD质粒含E8启动子及CD基因序列;Westem blot可检测到CD基因表达;125 I加5-FC组细胞存活率明显低于未经125 I照射组及未加5-FC组,与5-FU组相近.这表明放射性核素与基因治疗联合对肿瘤细胞具有协同杀伤作用.
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Survivin启动子介导自杀基因与突变体融合基因真核表达载体的构建
目的:构建Survivin启动子介导自杀基因胞嘧啶脱氨酶(CD)与Survivin Cys84Ala突变体(SurMut)融合基因的重组腺相关病毒质粒(pAM/SurP-CDglySurMut),探讨其在肿瘤细胞中有效表达融合基因的能力.方法:PCR扩增E.coli CD基因和带有甘氨酸(gly)连接体的Survivin突变体片段,亚克隆至具有Survivin启动子的腺相关病毒载体pAM/SurP,获得重组表达载体pAM/SurP-CDglySurMut.重组载体瞬时转染胃癌细胞,Western blot检测融合蛋白的表达.结果:经PCR扩增成功克隆E.coli CD基因和带有gly连接体的Survivin突变体片段.重组阳性克隆经限制性酶切鉴定和基因测序,证实目的基因CDglySurMut已正确插入pAM/SurP载体中.Western blot证实Survivin启动子能够驱动CDglySurMut融合基因在胃癌细胞中达.结论:pAM/SurP-CDglySurMut载体能够在肿瘤细胞中表达融合蛋白,为进一步探讨其靶向治疗肿瘤奠定了实验基础
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CD/5-FC自杀基因体系在正常免疫力动物体内的抑瘤及旁观者效应
目的:观察阳离子脂质体介导的CD/5-FC自杀基因体系协同γ-IFN在正常免疫力小型动物体内对肿瘤的抑制效应及远端旁观者效应.方法:采用阳离子脂质体介导CD基因质粒瞬时转染小鼠肝癌H22及空质粒转染的H22细胞,分别接种于KM鼠双侧前腋下皮下;向小鼠体内注射5-FC及γ-IFN,观察在γ-IFN协同作用下对转染CD基因瘤体的抑制作用和远距离空质粒转染瘤体的抑制即远端旁观者效应.结果:5-FC对转染CD基因侧瘤体抑制明显,抑制率为79.39%;在γ-IFN的协同下CD/5-FC的抑瘤作用得到了增强,抑制率为93.47%,与无γ-IFN协同作用相比,对癌细胞抑制率明显增强(t=3.49,P=0.0036);存在远端旁观者效应,远端未转染瘤体的抑制率为54.42%;在γ-IFN的协同下远端旁观者效应得到显著增强,抑制率达到88.43%,同无γ-IFN相比有差异有显著性(t=2.86,P=0.0212).结论:体内CD/5-FC自杀基因体系联合γ-IFN对肝癌细胞有更好的抑制效应,对肝癌的治疗有很好的应用前景.
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胞嘧啶脱氨酶基因联合放射治疗恶性肿瘤的研究进展(文献综述)
以胞嘧啶脱氨酶基因为主的自杀基因治疗已日渐引起肿瘤研究者的兴趣,近几年出现的基因联合放疗对恶性肿瘤的治疗,使两者之间的优势得以互补,大大增强了对肿瘤治疗的效果.本文就胞嘧啶脱氨酶基因联合放疗对恶性肿瘤治疗的作用机制、基因转导方法、靶向性表达、基因显像、治疗效果等方面予以综述.
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CD/5-FC对人直肠癌细胞辐射增敏作用的研究
尽管基因治疗肿瘤的基础和临床研究已取得很大成绩,但治疗效果仍不理想.我们观察了胞嘧啶脱氨酶基因(cytosine deaminase CD)和5-氟胞嘧啶(5-fluorouracil 5-FC)联合放射线对人直肠癌HR-8348细胞的杀伤作用,观察了CD/5-FC治疗的辐射增敏作用,探讨提高CD/5-FC治疗直肠癌的疗效的方法.
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人端粒酶逆转录酶启动子调控的携带胞嘧啶脱氨酶基因腺病毒载体的构建
目的 构建由人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)启动子驱动的含胞嘧啶脱氨酶自杀基因(cytosine deaminase gene,CD)的复制缺陷型腺病毒载体.方法 首先构建带有hTERT启动子及CD基因的穿梭质粒pSU-TP-CD,然后与腺病毒骨架质粒pBHGE3共转染到293细胞,通过细胞内同源重组法获得复制缺陷性病毒.结果 经PCR鉴定证明,成功构建了含有hTERT启动子及CD基因的重组腺病毒.结论 成功构建了携带hTERT启动子和CD基因的复制缺陷型腺病毒Ad-hTERTp-CD,为下一步进行基因治疗研究奠定了基础.
关键词： 人端粒酶逆转录酶启动子 胞嘧啶脱氨酶基因 腺病毒载体 -
人端粒酶逆转录酶启动子调控的胞嘧啶脱氨酶基因对宫颈癌细胞株的选择性杀伤作用研究
目的 探讨由人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)启动子驱动的含胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase,CD)基因的复制缺陷型腺病毒,对宫颈癌细胞的选择性杀伤作用.方法 将自行构建复制的缺陷型腺病毒载体Ad-hTERTp-CD,由端粒酶逆转录酶启动子调控的携带胞嘧啶脱氨酶基因的重组腺病毒,分别感染人宫颈癌细胞株Hela(研究组)及人胚肺成纤维细胞(human embryo lung fibroblast cells, hELF)(对照组),采用不同滴度重组腺病毒及不同浓度氟胞嘧啶(5-flurocytosine,5-FC)作用于Hela细胞(研究组)后,通过MTT法,检测研究组和对照组受染细胞的存活率,观察分析腺病毒载体对两种细胞的杀伤作用.结果 MTT法检测到研究组细胞存活率随病毒滴度和氟胞嘧啶浓度的增加,不断降低;而同样处理,对人胚肺成纤维细胞(对照组)也有部分杀伤作用,但远较Hela细胞(研究组)弱,两组比较,差异有显著意义(P<0.01).结论 本实验构建的复制缺陷型腺病毒Ad-hTERTp-CD对Hela细胞具有靶向杀伤作用.
关键词： 人端粒酶逆转录酶启动子 自杀基因 胞嘧啶脱氨酶基因 腺病毒载体 -
腺病毒介导CD/5-FC系统联合照射对口腔鳞癌细胞的增敏研究
放射治疗在口腔鳞癌治疗中起重要作用,对早期口腔鳞癌具有良好的疗效,然而对晚期的只能起姑息治疗作用.研究显示嘧啶类衍生物,如氟尿嘧啶(5-FU)可提高放射治疗的疗效.胞嘧啶脱氨酶基因/氟胞嘧啶(cytosine deaminase/5-fluorocytosine,CD/5-FC)自杀基因系统可将5-FC代谢成5-FU,因此CD/5-FC系统联合照射将提高其对口腔鳞癌细胞的杀伤作用.笔者采用成克隆分析法研究口腔鳞癌细胞应用CD/5-FC系统治疗后,对放射的增敏作用.
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CD/5-FC系统治疗口腔鳞癌移植瘤的研究
胞嘧啶脱氨酶基因(CD)/5-氟胞嘧啶(5-FC)自杀基因系统在多种恶性肿瘤治疗中具有强的杀伤作用,但在口腔鳞癌方面的研究仍较少,我们将CD/5-FC系统用于治疗口腔鳞癌移植瘤.
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融合基因CDglyES重组腺病毒对卵巢癌细胞抑制作用的体外研究
目的：构建含CDglyES融合基因的重组腺病毒，体外观察其对人卵巢癌细胞的直接抑制作用及其对血管内皮细胞生长的抑制作用。方法：用细菌内同源重组方法构建腺病毒穿梭质粒prAdCDglyES。采用脂质体介导转染293包装细胞，扩增获取重组腺病毒rAdCDglyES。采用MTT法观察rAdCDglyES对卵巢癌细胞SKOV-3生长抑制的影响，同时观察其表达产物抑制脐静脉血管内皮细胞ECV-304增殖的作用。结果：纯化的rAdCDglyES滴度是1×1013.3 TCID50/L，其对SKOV-3细胞生长抑制率是（83.1±6.3）%，与对照组rAd-LacZ（24.1±13.2）%相比有显著性差异（P<0.01）。浓缩的转染rAdCDglyES的细胞培养上清液抑制ECV-304细胞增殖，抑制率是（78.7±1.6）%，而同样浓缩的转染rAd-CD的细胞培养上清液抑制率是（23.9±9.7）%，二者有显著性差异（P<0.01）。结论：研究结果表明重组腺病毒rAdCDglyES具有体外直接和间接抑制人卵巢癌细胞效能。
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含胞嘧啶脱氨酶基因重组腺病毒的构建及其对肺癌抑制作用的研究
目的:构建含胞嘧啶脱氨酶基因(CD基因)重组腺病毒(AdE1CMVCD),并鉴定;用自杀基因治疗系统(AdE1CMVCD/5-FC)对肺癌进行抑瘤作用的实验研究.方法:体外实验:用不同稀释度的AdE1CMVCD转染人肺癌细胞H460后分别加入不同浓度的5-氟胞嘧啶(5-FC),用MTT法测OD570hm值,按公式计算细胞生长抑制率;体内实验:建立T739鼠肺腺癌荷瘤模型,瘤体内导入AdE1CMVCD,腹腔注射5-FC,观察实验组及各对照组瘤体及生存期差异.结果:该系统转染的人肺癌H460细胞生长抑制率随前药5-FC浓度及感染重组病毒剂量的增加而增加,大抑制率达61.29%,同时观察到了明显的旁杀伤作用;在体内实验中观察到AdE1CMVCD/5-FC对小鼠肺癌有明显的生长抑制作用,明显延长荷瘤小鼠生存期.结论:本文建立的AdE1CMVCD/5-FC系统体内外对肺癌均有明显的抑制作用,为临床肺癌基因治疗的应用奠定了基础。
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hTERT启动子调控腺病毒介导的CD基因治疗卵巢癌的实验研究
目的:构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子驱动的含胞嘧啶脱氨酶(CD)基因的复制缺陷型腺病毒载体,使CD基因只能在端粒酶阳性的细胞表达.方法:采用细胞内同源重组法构建出hTERT启动子调控的携带CD基因的复制缺陷型腺病毒Ad-hTERTp-CD,经PCR鉴定正确后进行扩增、纯化和滴度测定.分别将腺病毒感染人卵巢癌细胞株SKOV3及人胚肺成纤维细胞,MTT法检测受染细胞的存活率.结果:构建的重组腺病毒中带有hTERT启动子及CD基因.用不同滴度的重组腺病毒以及不同浓度的5-FC作用于SKOV3细胞后,MTT法检测到细胞的存活率随着病毒滴度和5-FC浓度的增加而不断降低;而同样的处理对人胚肺成纤维细胞的也有部分杀伤作用,但远较SKOV3细胞弱,差异有统计学意义(P＜0.01).结论:本实验构建的由hTERT启动子调控的携带CD基因的复制缺陷型腺病毒Ad-hTERTp-CD对SKOV3细胞具有靶向杀伤的能力.
关键词： 基因治疗 人端粒酶逆转录酶启动子 自杀基因 胞嘧啶脱氨酶基因 腺病毒载体 -
构建携带胞嘧啶脱氨酶基因骨髓间充质干细胞及其对胶质瘤细胞的体外抑制作用
背景:转染胞嘧啶脱氨酶基因的骨髓间充质干细胞能有效地将化疗前药5-氟尿嘧啶转化成具有细胞毒性的化疗药物5-氟尿嘧啶,并在体外对胶质瘤细胞有显著的生长抑制作用.目的:探讨以骨髓间充质干细胞为基因治疗载体表达外源基因胞嘧啶脱氨酶基因对胶质瘤C6细胞增殖的影响.方法:分离、培养小鼠间充质干细胞,构建胞嘧啶脱氨酶基因与GFP联合的慢病毒载体,通过慢病毒包装法将胞嘧啶脱氨酶基因及GFP转染至小鼠骨髓间充质干细胞,获得稳定表达胞嘧啶脱氨酶基因及GFP的骨髓间充质干细胞,使其与胶质瘤C6细胞共培养,在培养液中加入5-氟胞嘧啶后应用流式细胞仪检测胞嘧啶脱氨酶基因对胶质瘤细胞的增殖影响.结果与结论:慢病毒介导的胞嘧啶脱氨酶基因及GFP基因成功转染小鼠骨髓间充质干细胞形成C57BL/6 mMSC-codA/eGFP细胞,C57BL/6 mMSC-codA/eGFP在5-氟胞嘧啶的作用下可引起胶质瘤C6细胞的明显凋亡,在5-氟胞嘧啶浓度为1×106 μg/ L条件下C6胶质瘤细胞凋亡率为60%(P < 0.05).提示,C57BL/6 mMSC-codA/eGFP可将5-氟胞嘧啶转化成5-氟尿嘧啶并对C6胶质瘤细胞生长有显著的限制作用甚至是致死效应.
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肝癌双自杀基因逆转录病毒转染体系构建与鉴定
目的 进行肝癌双自杀基因逆转录病毒转移体系的建立及鉴定, 为后续将其转染肝癌细胞、并进行抗肝癌细胞株的功能实验和功效研究奠定基础.方法 采用基因工程的方法, 将pWZLneoC-DglyTK质粒转化到 DH5α 感受态菌后, 提取质粒 DNA, 并采用酶切和 PCR 及 A260 nm 和 A260 nm/A280 nm吸光度测定等方法进行分析鉴定; 再将其质粒DNA用脂质体介导转染PA317 细胞, 然后经G418 筛选阳性克隆, 进行扩增培养PA317/CD+TK细胞, 即成功构建含大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶( E. coli CD)和单状疱疹病毒胸苷激酶( HSV-tk)的肝癌双自杀基因逆转录病毒转移体系.结果 转化的阳性菌株可在含Amp的琼脂上生长; 质粒经1%琼脂糖凝胶电泳后可见有质粒 DNA 存在; 经单酶切和双酶切后, 分别显示相应的电泳条带; PCR鉴定可见有扩增出的CD和TK阳性条带, 测定DNA浓度为5. 25 μg/μl, 纯度为1. 81.同时, 两种质粒转入PA317 细胞48 h后荧光显微镜下可观察细胞内有绿色荧光产生, 其转染效率约为20% ~30% ; CD、 TK基因PCR分别扩增, 已整合到PA317 细胞基因组上, 其基因PCR产物的相应处分别有一特异性条带; 将RNA逆转录后进行PCR扩增, CD、 TK基因在 PA317 细胞中得到表达, 其基因RT-PCR产物的相应处也分别有一特异性条带; 另外, 透射电镜下观察到培养液上清液中病毒颗粒散在或聚集成堆, 呈圆球形, 边缘呈波状, 直径约100 nm.结论 采用上述方法并通过分析鉴定结果证实,已成功构建出肝癌双效自杀基因逆转录病毒转移体系, 这将为今后该体系对人类肝癌细胞系的 HepG2 及联合肝癌双效自杀基因前体药物并结合天然抗癌药物共济增效及代谢协同杀伤肝癌细胞奠定治疗物质和方法学基础.
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胞嘧啶脱氨酶基因突变体D314A对人结肠癌细胞的抑制作用
目的:构建大肠埃希菌胞嘧啶脱氨酶(E. coli cytosine deaminase,EC-CD)基因突变体D314A(即EC-CD基因开放阅读框第314位氨基酸由天冬氨酸突变为丙氨酸)并研究其抗肿瘤作用.方法:构建含EC-CD基因的真核表达质粒pcDNA3.1-CD~(wt),应用点突变技术将pcDNA3.1-CD中EC-CD基因开放阅读框第314位氨基酸的碱基由A突变为C,即构成pcDNA3.1-CD~(D314A).用Lipofectamine ~(TM) 2000将EC-CD基因或D314A基因转入人结肠癌细胞系LoVo细胞,以G418筛选出稳定表达的阳性克隆LoVo-CD~(wt)及LoVo-CD~(D314A).应用MTT法检测EC-CD基因及D314A基因对LoVo细胞的直接杀伤作用及旁观者效应.结果:成功构建EC-CD基因突变体D314A并经测序确认.LoVo细胞转染EC-CD基因及D314A基因后均能表达相应的mRNA,Lovo-CD~(D314A)细胞对5-FC的IC_(50)为(85.13±0.60)mmol/L,显著低于LoVo-CD~(wt)细胞的(689.76±0.45)μmoL/L,(P=0.000);在旁观者试验中,当LoVo-CD~(wt)细胞和LoVo-CD~(D314A)细胞比例均为30%时,细胞存活率分别为(48.5±0.49)%与(17.3±0.40)%(P=0.000).结论:EC-CD基因突变体D314A的抗LoVo细胞作用显著强于野生型EC-CD基因,有望成为新的肿瘤基因治疗候选基因.
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质粒表达载体pIRES-CD的构建及其在ACC-2细胞中的表达
目的:克隆大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(CD)基因.构建质粒表达载体pIRES-CD,并利用该载体转染ACC-2细胞,建立稳定表达大肠杆菌CD基因的ACC-2细胞克隆.方法:通过PCR从大肠杆菌DH5α DNA中扩增出CD基因全长序列,将扩增产物定向插入到克隆载体pMD18-T中,进行序列测定.测序正确后,将其亚克隆到质粒表达载体pIRES中,构建以内部核糖体进入位点(IRES)相连的CD基因的质粒表达载体pIRES-CD,采用电穿孔法,以质粒表达载体转染ACC-2细胞,用400μg/mL的G418筛选10d,获得稳定表达CD基因的ACC-2细胞系.提取该细胞的总RNA,用RT-PCR检测CD基因的表达.结果:PCR扩增出1280bp大小的片段,测序结果与GeneBank报道的CD序列基本一致:阳性重组质粒pIRES-CD经XbaI和NotI双酶切后,获得6.1kb和1280bp的片段;RT-PCR从转染细胞的总RNA中扩增出228bp的预期片段.结论:成功扩增了CD基因的DNA片段;成功构建了质粒表达载体pIRES-CD;建立了稳定表达CD基因的ACC-2细胞系,为CD/5-FC自杀基因系统在腺样囊性癌基因治疗中的应用奠定了基础.
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胞嘧啶脱氨酶基因联合干扰素-γ基因治疗大肠癌的实验研究
目的:研究胞嘧啶脱氨酶基因(EC-CD)联合干扰素-γ(INF-γ)基因对大肠癌的治疗作用.方法:以重组腺病毒载体AdCMVCD转导EC-CD基因;AdCMV INF-γ转导鼠INF-γ基因.采用体外培养和小鼠移植瘤实验,研究EC-CD基因联合INF-γ基因对CT26大肠癌细胞的杀伤作用.结果:AdCMV IFN-γ感染对CT26细胞生长有明显的抑制作用.AdCMVCD/5-FC联合AdCMV INF-γ可以增强对CT26细胞的杀伤作用,IC50明显变小(P＜0.01),肿瘤生长明显抑制(P＜0.01).组织学检查显示,EC-CD基因与INF-γ基因联合治疗后肿瘤内有大量淋巴细胞浸润.结论:EC-CD基因联合INF-γ基因可以明显增强抗肿瘤效应,局部淋巴细胞浸润增加可能起到一定作用.
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CD基因靶向治疗与放疗联合应用的研究进展
基因治疗作为治疗恶性肿瘤的1种新手段,正愈来愈受到重视和关注,肿瘤基因治疗的原理是将目的基因用基因转移技术导入靶细胞,使其表达此基因而获得特定的功能和效应,继而执行或介导对肿瘤的杀伤和抑制作用,终达到直接或是间接杀灭肿瘤细胞的目的.自杀基因疗法:又称病毒介导的酶-药物前体疗法(virys-directed enzyme prodrug therapy,VDEPT),是将某些细菌、病毒和真菌中的基因导入肿瘤细胞,使其编码的特异性酶类将原本对细胞无毒或毒性极低的药物前体在肿瘤细胞内代谢成毒性产物,达到杀死肿瘤细胞的目的,目前国内外研究较多.本文就其中CD/5-Fc体系近年来在恶性肿瘤的靶向治疗以及放疗的联合应用方面的研究进展作一综述.
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重组表达载体pIRES-CD、pIRES-TK的构建及其在ACC-2细胞中的表达
目的:运用分子生物学技术扩增CD、TK基因,进行其DNA序列分析,并构建真核表达质粒pIRES-CD及pIRES-TK,将其共同转染ACC-2细胞,为进一步研究双自杀基因对ACC-2细胞杀伤作用奠定基础.方法:根据CD和TK基因DNA的序列分别设计、合成引物,构建克隆载体pMD18-T-CD和pMD18-T-TK,并进行DNA序列分析;构建以内部核糖体进入位点(IRES)相连的CD和TK基因的真核表达质粒pIRES-CD及pIRES-TK,用电穿孔法以真核表达质粒共同转染ACC-2细胞,用RT-PCR检测CD和TK的表达.结果:克隆DNA片段和GeneBank上报道的CD、TK序列基本一致,且经酶切鉴定,CD、TK基因成功插入真核表达质粒IRES,RT-PCR检测表明,以真核表达质粒pIRES-CD及pIRES-TK共同转染的ACC-2细胞能表达CD和TK.结论:成功扩增了CD、TK的DNA片段,并进行了序列分析;成功构建CD和TK基因的重组真核表达质粒pIRES-CD及pIRES-TK,将其转染ACC-2细胞后能分泌性表达CD和TK,为肿瘤基因治疗的研究提供一定途径.
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融合自杀基因对骨肉瘤细胞作用的实验研究
目的 观察单纯疱疹病毒-胸苷激酶/胞嘧啶脱氨酶融合自杀基因(HSV-TK/CD)对骨肉瘤细胞增殖的影响.方法 将含TK/CD的重组腺病毒载体感染人骨肉瘤细胞系MG-63细胞,测定感染效率后,分别给予不同浓度的前体药物和不同感染复数的自杀基因重组腺病毒,计算瘤细胞增殖抑制率,MTF法测定细胞存活率,并用流式细胞术和Hochest 33342染色法分析杀伤机制.结果 含自杀基因的重组腺病毒成功感染MG-63细胞;不同感染复数和不同前体药物浓度下,融合自杀基因系统对瘤细胞的杀伤作用明显强于单基因和双基因相加的作用(P<0.05);其杀伤机制为致细胞坏死和细胞凋亡.结论 融合自杀基因HSV-TK/CD对骨肉瘤细胞系MG-63细胞的生长有明显的抑制作用.
