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EGS-C67抑制HCV基因表达及其抗病毒活性的测定
目的：基于丙肝病毒（HCV）基因组保守区5′UTR的序列，设计一段相应的外部引导序列（EGS），鉴定其体外靶向切割活性及胞内抗病毒作用。方法用计算机软件对HCV基因保守区的5′非翻译区（5′UTR）序列与结构进行分析，选择针对HCV第67位胞嘧啶C与第68位鸟嘌呤G之间的位点，作为设计的靶位，设计相应的EGS （ EGS-C67），将该EGS导入HCV感染的Huh7.5.1细胞，通过Northern blot及Western blot试验检测HCV基因的表达，通过荧光定量PCR检测EGS-C67的抗病毒活性。结果体外切割试验表明EGS-C67对HCV RNA片段具有明显的靶向引导活性。在宿主细胞内EGS-C67可显著抑制HCV基因的表达，可使Huh7.5.1细胞培养上清中HCV的滴度降低约150倍（ P＜0.01）。结论 EGS-C67作为一种新型抗HCV核酸分子，其成功构建为抑制HCV增殖提供了一种新的抗病毒策略。
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应用外部引导序列切割人巨细胞病毒UL148 RNA的研究
目的 研究人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)临床病毒株UL/b'区域UL148基因功能及抗HCMV治疗新策略,应用DNA性质外部引导序列(External guide sequences,EGS)在体外抑制UL148 RNA的表达.方法 应用RNA structure生物软件模拟UL148 RNA二级结构,选择二级结构相对简单的区域设计EGS,并合成EGS核苷酸序列.应用PCR方法分别扩增UL148及M1RNA基因,克隆至T7启动子下游,在T7 RNA聚合酶的作用下,体外转录UL148 RNA及M1RNA,其中UL148以32p标记并进行体外转录.混合EGS、M1RNA及UL148 RNA于切割反应液中,反应1h后,进行尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,Typhoon扫描仪观察结果.结果 根据UL148 RNA二级结构选取第58 ～72位碱基作为EGS结合区域,其切割位点位于57位,针对此区域设计EGS57,并在体外进行EGS57与UL148 RNA结合的二级结构的模拟,可形成M1RNA天然作用底物类似的茎环结构.在T7 RNA聚合酶的作用下,分别在体外转录M1RNA及UL148 RNA,其大小均与预期相符.经切割反应,可获得与预期切割位点相符的切割条带.结论 EGS57可切割UL148RNA,其切割位点准确,与预期相符.该研究为进一步探讨UL148基因功能提供有效基因沉默工具.
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人类核糖核酸酶P的研究进展
人类核糖核酸酶P是具有酶活性的核糖核蛋白复合体.根据靶RNA设计的外部引导序列(EGS)能与靶RNA碱基互补结合,形成类似前体tRNA的二级结构,从而引导人类核糖核酸酶 P对靶RNA进行特异切割.因此,基于人类核糖核酸酶P的EGS技术能在mRNA水平抑制病毒及肿瘤靶基因的表达,在抗肿瘤、抗病毒等基因治疗领域具有广阔的应用前景.
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RNase P体外靶定切割人巨细胞病毒UL54 mRNA片段研究
目的:观察大肠埃希菌Rnase P催化亚基M1 RNA 在细胞外水平上对人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)DNA 聚合酶UL54 mRNA的切割效果,探讨核酶作为新型抗病毒制剂的应用前景.方法:针对HCMV UL54 mRNA设计特异性的外部引导序列(external guide sequences,EGSs)EGS-T6,观察其引导M1 RNA特异的细胞外切割活性.结果:在EGS-T6 引导下,大肠埃希菌Rnase P 催化亚基M1 RNA 在细胞外可特异地对靶mRNA 进行有效切割.结论:EGS-T6具备引导M1 RNA 对UL54 mRNA 特异切割的能力,可发展成一种新型抗病毒制剂.
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RNase P核酶对人巨细胞病毒UL54基因mRNA体外切割作用
外部引导序列(EGSs)是mRNA靶序列互补并引导RNase P切割的小RNA片段.我们设计与人巨细胞病毒HCMV(Human Cytomegalovirus) UL54基因mRNA序列互补的EGSs,将其与大肠杆菌来源RNase P催化核心M1 RNA构建成M1GS核酶.通过对UL54基因亚克隆片转录产物体外切割研究,证实该核酶具备对UL54 mRNA片段的特异切割能力,可以发展成为一种抗病毒试剂.
关键词： 人巨细胞病毒HCMV ul54基因 RNase P 外部引导序列
