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应用外部引导序列切割人巨细胞病毒UL148 RNA的研究
目的 研究人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)临床病毒株UL/b'区域UL148基因功能及抗HCMV治疗新策略,应用DNA性质外部引导序列(External guide sequences,EGS)在体外抑制UL148 RNA的表达.方法 应用RNA structure生物软件模拟UL148 RNA二级结构,选择二级结构相对简单的区域设计EGS,并合成EGS核苷酸序列.应用PCR方法分别扩增UL148及M1RNA基因,克隆至T7启动子下游,在T7 RNA聚合酶的作用下,体外转录UL148 RNA及M1RNA,其中UL148以32p标记并进行体外转录.混合EGS、M1RNA及UL148 RNA于切割反应液中,反应1h后,进行尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,Typhoon扫描仪观察结果.结果 根据UL148 RNA二级结构选取第58 ～72位碱基作为EGS结合区域,其切割位点位于57位,针对此区域设计EGS57,并在体外进行EGS57与UL148 RNA结合的二级结构的模拟,可形成M1RNA天然作用底物类似的茎环结构.在T7 RNA聚合酶的作用下,分别在体外转录M1RNA及UL148 RNA,其大小均与预期相符.经切割反应,可获得与预期切割位点相符的切割条带.结论 EGS57可切割UL148RNA,其切割位点准确,与预期相符.该研究为进一步探讨UL148基因功能提供有效基因沉默工具.
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人巨细胞病毒临床病毒株UL148基因的体外表达及功能位点预测
目的 体外获得人巨细胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)临床病毒株 UL148 RNA及探讨其基因功能.方法 将感染HCMV的新生儿尿液接种人胚肺细胞,分离HCMV临床病毒株,并经多重PCR鉴定.扩增UL148基因,经双酶切后克隆入pGEM-T-Easy质粒,构建重组质粒,并置于T7启动子下游,经重组质粒、PCR产物、双酶切产物电泳鉴定及序列测定.克隆成功的质粒以32P标记,进行体外转录RNA.根据UL148序列特征应用生物信息学分析其翻译后修饰位点.结果 成功在体外获得HCMV临床病毒株,经电泳及序列测定证实重组质粒构建成功,在T7 RNA聚合酶作用下,体外获得UL148 RNA.翻译后修饰位点显示UL148基因存在1个与细胞黏附相关的特征序列,1个豆荚外源凝集素β-链标记位点、2个N-豆蔻酰化位点,1个酪氨酸激酶Ⅱ磷酸化位点,7个蛋白激酶C磷酸化位点,1个cAMP/cGMP-依赖性蛋白激酶磷酸化位点和2个N-糖基化位点,1个跨膜区域.结论 UL148基因编码产物可能为一个病毒黏附分子,参与宿主细胞的信号转导作用.
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广州地区人巨细胞病毒临床低传代株UL138基因的序列特征及多态性分析
目的：研究广州地区新生儿感染人巨细胞病毒（ HCMV）临床低传代分离株UL138基因序列特征与多态性。方法从10例被证实为临床HCMV感染的新生儿尿液标本中分离HCMV低传代临床病毒株，进行多重PCR鉴定。对临床分离株进行HCMV UL138基因扩增、克隆、鉴定、测序及呈报GenBank；同时在GenBank搜索HCMV UL138同源序列，行序列分析，应用生物信息学在线软件分析UL138基因翻译后修饰位点、二级结构及等电点。结果成功分离3株HCMV临床病毒株，分别命名为 HCMV D3、D2和 D52。克隆测序后呈报 GenBank 并被收录。收录序列号分别为：DQ180375、DQ180387和DQ180359。分析结果显示在HCMV临床低传代D3、D2和D52病毒株UL138基因全序列841个碱基中，存在16个位点变异，可能编码的蛋白质氨基酸残基总数为169个，其基因序列高度保守，核苷酸变异均为碱基替换，无插入或缺失，碱基替换导致了7处氨基酸的改变。HCMV UL138蛋白翻译后修饰位点在除Toledo株外的所有分离株中均高度保守；所有分离株UL138蛋白的预测等电点均为6．51。结论广州地区感染婴儿的HCMV UL138基因及其编码的氨基酸序列极为保守，但仍具有一定的多态性，这在HCMV临床感染与致病机制研究中具有重要意义。
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人巨细胞病毒临床低传代病毒株D2的UL140基因B细胞表位生物信息学特征
目的 探讨广东省妇幼保健院分离鉴定的人巨细胞病毒(HCM V)临床低传代病毒株D2(以下简称为HCMV D2)的UL140基因B细胞表位的生物信息学特征.方法 采用2016年3月至2017年3月,于广东省妇幼保健院新生儿科确诊感染HCM V的10例新生儿新鲜尿液标本中,分离鉴定的HCMV D2为研究材料.采用生物信息学方法,包括隐马尔可夫模型(TMHMM)预测HCMV D2 UL140基因跨膜结构,ExPASy在线序列分析平台预测基因的亲水性、表面可及性、极性、柔韧性及抗原性参数,以及GOR(Garnier-Osguthorpe-Robson)、人工神经网络预测法(HNN)、改进型自我优化预测结构(SOPMA)预测UL140基因二级结构.综合分析上述预测结果 ,并计算UL140基因的氨基酸残基抗原指数(AI),总结UL140基因B细胞表位的生物信息学特征.结果来自广东省妇幼保健院感染HCMV新生儿的HCMV D2 UL140基因的氨基酸包含191个氨基酸残基,相对分子质量为21.5×103,等电点为5.12.UL140基因B细胞表位的生物信息学特征包括:①TMHMM预测UL140基因存在1个跨膜区域,为26-48aa,细胞外区域为1-25aa.②ExPASy在线序列分析平台预测UL140基因的亲水性位于14-22、66-72、76-95、113-125、136-148、55-160、167-176aa;表面可及性位于5-22、50-60、64-96、132-160、167-187aa;极性位于5-22、45-98、103-128、132-187aa;柔韧性位于16-26、75-100、104-113、136-160aa;抗原性位于9-18、53-58、82-88、115-124、136-146、164-187aa.③U L140基因二级结构预测结果为,无规则卷及 β-转角主要位于1-8、13-25、79-95、103-113、153-159aa.④计算UL140基因氨基酸残基的AI较高区域的结果显示,5-10、14-22aa区域的AI较高.结论 HCMV D2 UL140基因B细胞表位,可能位于的区域为5-10、14-22aa或其附近.
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广州地区人巨细胞病毒临床低传代株UL140基因的多态性
目的 研究广州地区人巨细胞病毒(HCMV)临床低传代分离株UL140基因的多态性.方法 对3株经多重PCR鉴定的HCMV临床低传代分离株UL140基因进行全序列扩增、克隆、鉴定、测序及呈报Genbank,应用生物信息学方法分析UL140基因翻译后修饰位点、二级结构及等电点.结果 成功分离3株HCMV临床病毒株(D2、D3、D52),经鉴定后被GenBank收录.序列号分别为:DQ180373、DQ180385和DQ180357.分析显示HCMV临床低传代D2、D3和D52病毒株的UL140基因全长576 bp,其DNA序列比较保守,编码蛋白由191个氨基酸残基组成,HCMV UL140蛋白翻译后修饰位点在所有分离株中均比较保守;所有株外,其余分离株UL140蛋白的等电点均在4.88-5.12之间.结论 广州地区人巨细胞病毒UL140基因及其编码的氨基酸序列相对保守,但仍存在一定的多态性,与Toledo相比,本地区分离得到病毒株具有其明显差异,这一差异可能对HCMV临床感染与致病机制研究具有重要影响.
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广州地区HCMV临床病毒株UL137基因的结构特征与多态性
[目的]研究广州地区新生儿感染人巨细胞病毒(HCMV)临床低传代分离株UL137基因的结构特征与基因多态性.[方法]从62份被证实为临床HCMV感染的新生儿尿液标本中分离获得3株低传代临床病毒株,经多重PCR鉴定后分别命名为HCMV D2、D3和D52.对3株临床分离株进行HCMV UL137基因全序列PCR扩增,PCR产物纯化后进行基因克隆,构建HCMV UL137-pMD18-T重组质粒;基因测序;将HCMV UL137基因序列呈报GenBank,并进行基因生物信息学分析.[结果]成功从广州地区新生儿感染HCMV患儿体内分离3株HCMV临床病毒株.克隆测序后呈报GenBank并被收录,收录序列号分别为:DQ180388、DQ180376、DQ180360.通过序列分析,结果显示低传代分离株UL137基因DNA序列高度保守,同源性在96.91%～100%之间.其变异均为碱基替换;编码蛋白均由96个氨基酸残基组成,同源性在90.63%～100%之间,超半数的变异发生在第61～81位氨基酸残基之间;编码蛋白翻译后修饰位点包括PKS、MYS、cAMPs三类,其中4个PKS和44～49位的MYS高度保守,cAMPs位点仅在5株病毒出现;编码蛋白等电点在11.50～12.00之间,呈强碱性.[结论]广州地区临床低传代分离株HCMV UL137基因核苷酸序列及其编码蛋白的氨基酸序列极为保守,但仍存在一定多态性.提示HCMV UL137 ORF可能是一个具有重要功能的基因.
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多重PCR方法鉴定人巨细胞病毒临床病毒分离株
目的:应用多重PCR技术鉴定体外培养、分离获得的人巨细胞病毒(HCMV)临床病毒株.方法:以先天性感染HCMV的新生儿为研究对象,采集尿液标本进行病毒分离,将分离获得的临床低传代病毒感染HELF细胞,提取病毒DNA,针对较保守基因IE和LA,设计两对引物,同时扩增IE和LA基因,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析.结果:成功分离获得2株HCMV临床低传代病毒株(D2、D3),经多重PCR同时扩增出209 bp(IE)和401 bp(LA)目的片段.结论:多重PCR可以作为病毒分离后,基础研究中鉴定HCMV临床病毒株的一种方法.
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广州地区人巨细胞病毒临床低传代病毒株D3的UL147基因B细胞抗原表位的生物信息学分析
目的 应用生物信息学方法分析广州地区人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)临床低传代病毒株D3的UL147基因B细胞抗原表位.方法 应用生物信息学方法:用TMHMM预测跨膜区域,用改进型自我优化预测结构(SOPMA)、Garnier-Osguthorpe-Robson (GOR)法、人工神经网络预测法(HNN)预测二级结构,用Hopp&Woods亲水性方案、Janin可及性方案、Welling抗原性方案等参数预测UL147基因抗原表位.结果 临床低传代HCMV病毒株D3的UL147基因包含159个氨基酸残基,等电点为9.56;UL147存在一个跨膜区域,为20～ 42 aa区域,胞外区域为1～ 19 aa区域;无规则卷及β-转角区域主要位于12～ 17、22～ 28、31～48、99～109、130～145 aa区域;亲水性位于15～ 39、101～111、135～ 143 aa区域;可及性位于14～ 45、103～124、131～ 143 aa区域;抗原性位于9～14、63～70、108～116 aa区域.结论 临床低传代HCMV病毒株UL147基因抗原表位可能位于7～ 12 aa区域或其附近.
