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逆转录病毒载体PLIL-2SN转导人CD3AK细胞方法的建立
目的:探讨CD3AK细胞在基因治疗中的应用,并对逆转录病毒载体转导CD3AK细胞IL-2基因的方法进行研究.方法:利用逆转录病毒载体PLIL-2SN向人CD3AK细胞中导入IL-2基因.结果:从转导细胞中RT-PCR扩增出347bpNeoR基因特异性片段,并测出培养上清液中IL-2浓度为3.276μg·L-1.结论:转导的IL-2基因得到表达,转导成功.这有助于进一步研究转导后淋巴细胞的功能,以开展基因免疫治疗的研究.
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逆转录病毒介导IL-2cDNA治疗小鼠淋巴瘤的研究
目的:研究人白细胞介素-2(hIL-2)转基因小鼠淋巴瘤体内成瘤性.方法:体外将hIL-2基因转入小鼠淋巴瘤p388细胞.用PCR、RT-PCR、dot blot法检测hIL-2基因在细胞内的整合及表达,四甲基偶氮唑盐比色(MTT)法检测转导细胞hIL-2分泌.体内试验将动物分为A9组、对照组和体内转染治疗组3组.17-d后处死所有动物,观察肿瘤生长状况.结果:hIL-2基因已成功地整合到小鼠p388细胞基因组内.p388/IL-2细胞分泌的hIL-2 量为37.4-U.ml-1.A9组和体内转染治疗组动物肿瘤体积明显减小,与对照组肿瘤体积有显著性差异(P<0.05).结论:hIL-2基因经体内或体外法转入p388/IL-2细胞后减弱了在小鼠体内的致瘤性.
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表达人泛素样修饰子基因细胞株的构建及其鉴定
目的:构建人泛素样修饰子(hUBL)基因的逆转录病毒载体并转染293T细胞,以探讨其生物学功能.方法:将hUBL克隆到原核表达质粒PET28a中,构建重组质粒PET28a-hUBL,转化BL21菌,以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.用其纯化蛋白免疫小鼠,获得多克隆抗体.重组蛋白用Western blot鉴定.将hUBL基因克隆到逆转录病毒质粒中并转染293T细胞,用免疫组化染色法鉴定hUBL基因的表达.结果:hUBL在大肠杆菌中获得高效表达,并纯化了hUBL-PET28a的融合蛋白,以此为抗原制备了高效价的抗hUBL蛋白的小鼠多克隆抗体.免疫组化染色表明,hUBL重组逆转录质粒可在293T细胞中高效表达hUBL蛋白.结论:成功地构建了hUBL重组逆转录病毒载体,使得其在293T细胞中表达,获得稳定表达的细胞株.
关键词： 人泛素样修饰子(hUBL) 基因克隆 蛋白表达 逆转录病毒载体 293T细胞 -
HSV-TK/GCV自杀基因系统治疗小鼠乳腺癌的研究
目的:探讨HSV-TK/GCV自杀基因系统对小鼠乳腺癌细胞系MA782/5S-8102形成肿瘤的体内杀伤作用及其产生的旁观者效应.方法:体内实验分动物致瘤组、抑瘤实验组和治疗实验组.分别按实验组别要求接种5.0×106细胞/只于BALB/C小鼠的右腋窝皮下,观察各组肿瘤形成及肿瘤治疗情况并统计各组生存期.治疗结束后将标本制成石蜡切片进行病理学分析,RT-PCR检测HSV-TK基因在肿瘤组织中的表达情况.统计学处理采用SPSS软件进行完全随机的方差分析(ANOVA).结果:实验结果显示小鼠成瘤率为100%.丙氧鸟苷(ganciclovir,GCV)可明显抑制MA782/5S-8102/TK细胞在BALB/C小鼠体内的肿瘤形成.经GCV治疗后,MA782/5S-8102/TK组和混合细胞组的肿瘤体积分别较对照组肿瘤体积缩小约36.7%和28.6%(均P＜0.001);生存期也明显延长(P＜0.001);RT-PCR检测HSV-TK基因在肿瘤组织中有表达.实验组肿瘤组织与对照组相比存在明显的病理学改变.结论:逆转录病毒可介导HSV-TK基因转入小鼠乳腺癌细胞MA782/5S-8102并获稳定表达,HSV-TK/GCV自杀基因系统在体内对乳腺癌细胞有杀伤作用,且存在明显的旁观者效应.
关键词： 单纯疱疹病毒胸苷激酶 丙氧鸟苷 旁观者效应 逆转录病毒载体 小鼠乳腺癌 -
含自杀基因酵母菌Fcy::Fur融合基因重组逆转录病毒表达载体的构建与鉴定
目的:构建并鉴定含自杀基因酵母菌Fcy::Fur融合基因的重组逆转录病毒表达载体,拟将用于肿瘤的基因治疗研究.方法:设计一对PCR引物,在引物的5＇端分别引入EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点,以质粒pORF5-Fcy::Fur为模板,采用常规PCR方法扩增Fcy::Fur融合基因,并将其分别克隆进测序载体PCS2+及原核表达载体pGEX-6p-1进一步进行核酸序列测定和原核诱导表达研究.用EcoRⅠ和BamHⅠ将Fcy::Fur融合基因从测序载体上切出,按正确阅读框架克隆进pLXSN中,重组子鉴定采用PCR法和酶切消化.结果:序列测定表明,扩增的基因即为Fcy::Fur序列,Fcy::Fur融合基因在大肠杆菌中获得了融合表达;重组逆转录病毒表达载体经PCR及双酶切鉴定表明:Fcy::Fur以正确方向插入到pLXSN中.结论:成功构建含有自杀基因Fcy::Fur的逆转录病毒表达载体,为进一步进行肿瘤实验性基因治疗奠定基础.
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逆转录病毒载体介导的hLIF基因真核稳定表达体系的建立
目的 构建逆转录病毒载体介导的人白血病抑制因子(human leukemia inhibitory factor,hLIF)基因真核稳定表达细胞株.方法 采用DNA重组技术,构建并鉴定重组逆转录病毒载体pEGZ/MCS-HA-hLIF;以脂质体转染法,将重组逆转录病毒载体与辅助质粒HIT456、HIT60共转染入包装细胞系293T包装逆转录病毒,感染人胚肾成纤维细胞系,经zeocin筛选获得真核稳定表达细胞株;采用RT-PCR法和ELISA法鉴定hLIF基因的转录和翻译,并检测表达上清中hLIF因子对人白血病细胞HL-60的生物学活性.结果 PCR产物电泳后于609 bp处见特异性条带.双酶切出现两条带,其中位于609 bp处可见相应条带.核酸测序结果与GenBank中所报道的hLIF基因的CDS序列完全一致.RT-PCR结果显示表达细胞中存在hLIF基因转录,ELISA结果测定表达上清中hLIF的浓度为110.134 pg/ml.结论 携带hLIF基因的重组逆转录病毒载体pEGZ/MCS-HA-hLIF构建成功,并且获得了稳定表达hLIF基因的人胚肾成纤维细胞株,这为此基因的临床应用和实验研究打下了基础.
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胰岛素基因逆转录病毒载体在人骨髓间充质干细胞表达的实验研究
目的构建携带胰岛素基因逆转录病毒载体,使其在人骨髓间充质干细胞(hMSCs)内稳定表达.方法通过RT-PCR法从人胰腺组织中提取胰岛素基因片段,并将其连接入逆转录病载体pLNCX,经包装细胞PT67的包装后,获得含外源性胰岛素基因的病毒颗粒(病毒滴度达4.2×106 cfu/ml)并感染hMSCs,经过G418筛选后,用RT-PCR法、免疫荧光法、放射免疫法、葡萄糖刺激试验分析胰岛基因的表达情况.结果携带胰岛素基因的逆转录病毒载体构建成功,转导入hMSCs后能够稳定表达胰岛素基因,并分泌至细胞外持续3周以上,但对葡萄糖刺激无明显反应.结论重组人胰岛素基因逆转病毒载体能够将胰岛素基因导入hMSCs并稳定表达.
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TIMP-2逆转录病毒载体的构建及表达
目的构建人组织型基质金属蛋白酶抑制剂2(TIMP-2)编码序列基因逆转录病毒表达载体,转染人单核细胞白血病细胞株,为探讨TIMP-2的生物学功能奠定基础.方法根据基因库中已公布的序列设计引物,用PCR方法扩增出人TIMP-2编码序列基因片段,用限制性内切酶及T4连接酶将目的片段插入MSCV逆转录病毒载体中.采用酶切和PCR鉴定及测序后经脂质体介导转染至PT67包装细胞中,以病毒上清感染单核细胞白血病细胞株SHI-1,G418筛选,极限稀释法挑选单克隆细胞株,定量PCR和Western Blotting检测TIMP-2的表达.结果 TIMP-2基因克隆进逆转录病毒载体MSCV中,经酶切、PCR和DNA测序证实重组逆转录病毒载体构建正确,病毒上清感染SHI-1细胞,经G418筛选并挑选出单克隆细胞,经实时定量PCR和Western Blotting检测发现SHI-1细胞中TIMP-2 mRNA及蛋白表达明显上调.结论成功构建了高表达TIMP-2的SHI-1细胞,可对其生物学行为作进一步研究.
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K-ras突变基因的克隆及逆转录病毒pEGZ/MCS HA载体的构建
目的克隆K-ras癌基因,测定其序列及突变类型,构建逆转录病毒表达载体.方法通过逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法从胰腺癌细胞株中克隆K-ras基因,与T-Vector载体连接后测序.构建含K-ras基因的逆转录病毒载体.结果胰腺癌细胞株Bxpc-3、Sw1990未及点突变,Patu8988 12位密码子的GGT突变为GTT,13、61位无突变.酶切证明逆转录病毒表达载体构建成功.结论 K-ras癌基因的成功克隆及逆转录病毒表达载体的构建,为胰腺癌的免疫治疗研究奠定了基础.
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人IL-18结合蛋白cDNA的克隆及其逆转录病毒载体的构建
目的克隆人白细胞介素-18结合蛋白(hIL-18BP)的cDNA及构建hIL-18BP逆转录病毒载体,以研究IL-18BP与IL-18相互作用的机制及自身免疫性疾病的基因治疗.方法从中国汉族人胎盘组织中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增hIL-18BP cDNA,与载体pcDNA3连接,转化大肠杆菌DH5α.得到的重组质粒经鉴定正确后,再作为模板进行PCR.PCR产物插入逆转录病毒载体pLNCX中.结果 RT-PCR扩增出全长585 bp的hIL-18BP cDNA,2次酶切鉴定证明hIL-18BP已分别与pcDNA3、pLNCX重组.2次测序结果均与国外文献报道的hIL-18BP的序列一致.结论成功地克隆了中国人IL-18BP cDNA,并构建了重组hIL-18BP逆转录病毒载体.
关键词： 白细胞介素-18结合蛋白 克隆 逆转录病毒载体 -
小鼠白细胞介素-18 cDNA的克隆及逆转录病毒载体的构建
目的克隆小鼠白细胞介素-18 cDNA(mIL-18 cDNA),构建mIL-18 cDNA逆转录病毒载体.方法利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法从昆明小鼠肝脏细胞中扩增出mIL-18 cDNA,克隆到测序载体pBluscript中,测序后,再亚克隆到逆转录病毒载体pLNCX中.结果RT-PCR扩增出约840 bp片段,经酶切鉴定显示mIL-18 cDNA逆转录病毒载体(mIL-18pLNCX)构建成功.结论昆明小鼠mIL-18 cDNA与已发表的其他种小鼠的序列相同,mIL-18 cDNA可能无种间差异.我们已成功地把mIL-18 cDNA克隆到逆转录病毒载体pLNCX中.
关键词： 小鼠白细胞介素-18 克隆 逆转录病毒载体 -
慢病毒载体介导的针对端粒酶的RNA干扰技术对HepG2细胞的体外效应
目的 观察针对hTERT的siRNA对肝癌HepG2细胞的体外抑制效应.方法 将逆转录表达载体中的针对hTERT的siRNA序列亚克隆至慢病毒表达载体pWPT-GFP中,经293T细胞包装,收集病毒上清,感染肝癌细胞株HepG2.采用半定量RT-PCR法、TRAP法及MTT法,分别检测hTERT基因表达、端粒酶活性、肿瘤细胞生长抑制情况等.结果 限制性内切酶酶切分析表明成功构建了靶向人端粒酶逆转录酶的干扰RNA的慢病毒表达载体;以293T包装的重组慢病毒能够高效感染肝癌细胞,感染效率可达99%以上;在稳定表达pWPT-hTERT-siRNA的肝癌细胞中,hTERT mRNA表达水平、肿瘤细胞的体外增殖受到抑制.结论 慢病毒介导的siRNA转染能明显抑制恶性肝癌细胞的生长.
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构建含绿色荧光蛋白和潮霉素抗性基因重组逆转录病毒载体的实验研究
目的 构建含增强绿色荧光蛋白(EGFP)和潮霉素抗性(Hyg)重组逆转录病毒载体.方法 将Hyg和EGFP基因片段分别插入逆病毒载体质粒pCMV-LL-SA-2中,构建重组的逆病毒质粒pCMV-EGFP-hyg与质粒pCMV-G和pCMV-GP共转染293T细胞产生重组逆病毒,感染白血病细胞株K562.结果 成功构建重组逆病毒载体质粒pCMV-EGFP-hyg,与质粒pCMV-G和pCMV-GP共转染293T细胞后24 h和48 h,细胞培养上清中的病毒滴度分别为7.5×105CFU/ml和1.5×106 CFU/ml.K562细胞经与产毒293T细胞协同培养感染重组逆病毒后,表达EGFP的阳性细胞比率为59.6%.经Hyg筛选后,98%以上的K562细胞为EGFP表达细胞.结论 成功构建了含EGFP和Hyg的重组逆转录病毒载体,可以产生较高滴度的目的 病毒;并且建立了稳定持久表达EGFP的K562白血病细胞系.
关键词： 绿色荧光蛋白 潮霉素 逆转录病毒载体 白血病细胞株K562 -
PIG-A基因逆转录病毒表达载体及包装细胞系的建立
目的 构建含磷脂酰肌醇聚糖A类基因(PIG-A)的逆转录病毒载体并对其进行包装,获得稳定的产毒细胞系.方法 采用PCR方法从质粒pEBPIG-A中扩增PIG-A基因片断,Bam HⅠ及XhoⅠ双酶切后连接至逆转录病毒载体pLEGFP-C1,用限制性内切酶和DNA序列测定的方法对重组质粒进行鉴定.脂质体法转染PA317包装细胞,荧光显微镜下观察EGFP瞬时表达,G418筛选抗性克隆,收集病毒上清后感染NIH3T3细胞测定病毒滴度.结果 酶切证实PIG-A基因克隆至逆转录病毒载体,测序结果和原始序列相同.重组逆转录病毒载体转染PA317包装细胞,24～48h后荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白的表达.经G418筛选得到6个稳定抗性克隆,病毒滴度高达1.6×105CFU/ml.结论 构建了含PIG-A基因的逆转录病毒载体,获得了稳定的产毒细胞系.
关键词： 逆转录病毒载体 含磷脂酰肌醇聚糖A类基因 增强型绿色荧光蛋白 -
以绿色荧光蛋白为标志研究对肿瘤细胞的基因转移
目的建立以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)示踪肿瘤细胞的方法.方法用编码EGFP的逆转录病毒分别转导人白血病细胞K 562、乳腺癌细胞MCF7和膀胱癌细胞5637,G418选择获得EGFP标记的肿瘤细胞.EGFP基因的整合与表达分别用聚合酶链反应(PCR)、流式细胞术(FCM )及荧光显微镜分析.结果 EGFP 病毒转导的3种肿瘤细胞内均有EGFP基因和NeoR基因的整合;与对照细胞相比,E GFP病毒转导可使EGFP阳性细胞的比例提高到85.5%～90.0%.结论携带 EGFP基因的逆转录病毒载体能在肿瘤细胞稳定表达,可用于研究肿瘤细胞的生长、转移和血管生成.
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IL-2基因转移对CD3AK细胞生物学功能的影响研究
白细胞介素-2(IL-2)是T细胞活化分泌,能与T细胞上IL-2R结合后,增强T细胞增殖的一种重要的细胞因子.CD3AK细胞是利用抗CD3单克隆抗体与TCR/CD3复合体的结合,同时提供少量外源IL-2,激活产生的具有细胞毒效应的杀伤细胞,常用于过继免疫治疗.临床资料表明体内使用外源性IL-2常导致毒副作用.能否利用基因转移技术将IL-2基因导入CD3AK细胞,使其表达并维持CD3AK的活化状态呢?抗CD3McAb活化的T细胞作为逆转录病毒载体的受体细胞,已有应用于IL-1β基因转移研究的报道.本实验利用逆转录病毒载体将IL-2基因导入CD3AK细胞中,探讨基因转移对CD3AK细胞生物学功能的影响.
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RV-HSV-TK/GCV自杀基因系统治疗宫颈癌的实验研究
目的探讨单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙氧鸟苷(HSV-TK/GCV)自杀基因系统对人宫颈癌细胞系Hela体外及体内的杀伤作用及其产生的旁观者效应.方法采用脂质体转染法将GINaTK载体转入包装细胞PA317.取病毒上清液感染人宫颈癌细胞Hela,得到带有HSV-TK基因的Hela/TK细胞,并将其分别用于体外和体内实验.体外实验中,Hela/TK细胞对丙氧鸟苷(GCV)的敏感性和旁观者效应采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定.动物试验中分别在BALB/C小鼠的右腋窝皮下按不同比例注射Hela/TK细胞和Hela细胞,然后给予GCV治疗.逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测肿瘤组织中HSV-TK基因的表达情况.结果转染HSV-TK基因的Hela/TK细胞表现出比亲本Hela细胞更强的杀伤肿瘤效应.体外实验结果显示,当Hela/TK细胞数占混合细胞10%时,低浓度(10μg·ml-1)的GCV就可将50%左右的肿瘤细胞杀死.体内实验结果显示,GCV可明显抑制Hela/TK细胞在BALB/C小鼠体内的肿瘤形成.经GCV治疗后,Hela/TK组和混合细胞组肿瘤体积分别较对照组肿瘤体积缩小52.8%和69.4%(均P＜0.001).小鼠的平均生存期也显著延长(P＜0.001).结论逆转录病毒可介导HSV-TK基因转入人宫颈癌细胞Hela并获稳定表达,HSV-TK/GCV自杀基因系统在体内外对宫颈癌细胞均有杀伤作用,且存在明显的旁观者效应.
关键词： 宫颈癌 自杀基因治疗 单纯疱疹病毒胸苷激酶基因 旁观者效应 逆转录病毒载体 -
单纯疱疹病毒胸苷激酶丙氧鸟苷自杀基因系统对宫颈癌Hela细胞系体外杀伤作用的研究
目的:观察单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)丙氧鸟苷(GCV)自杀基因系统对人宫颈癌Hela细胞系体外杀伤作用及其旁观效应. 方法:采用脂质体转染法将GINaTK载体转入包装细胞PA317.取病毒上清液感染Hela细胞,得到带有HSV-TK基因的Hela/TK细胞,并将其用于体外实验. 结果:载体HSV-TK导入了PA317细胞.体外实验结果显示,当Hela/TK细胞数占混合细胞10%时,低浓度(10 mg/L)的GCV就可将50%左右的肿瘤细胞杀死.GCV作用后的实验组Hela /TK细胞基因组经琼脂糖凝胶电泳后可观察到典型的DNA梯状条带. 结论:逆转录病毒可介导HSV-TK基因转入人宫颈癌Hela细胞并获稳定表达,HSV-TK/GCV自杀基因系统在体外对宫颈癌细胞有杀伤作用,且存在明显的旁观效应.
关键词： 单纯疱疹病毒胸苷激酶 旁观效应 逆转录病毒载体 人宫颈癌 自杀基因治疗 -
神经干细胞的体外培养及增强型绿色荧光蛋白基因转染研究
目的探索大鼠胚胎神经干细胞(NSCs)的体外培养,探讨NSCs作为基因靶细胞,以及逆转录病毒介导增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记NSCs的可行性.方法胚胎大鼠脑组织分离神经干细胞,无血清培养,免疫组织化学技术鉴定.用Lipofectin将pLEGFP-N1逆转录病毒载体导入PA317包装细胞,用G418筛选获得抗性细胞克隆,扩增抗性细胞并收集病毒上清;病毒上清感染神经干细胞,用G418筛选,荧光显微镜下观察并挑选EGFP表达强的克隆,并做免疫组化鉴定;进一步培养扩增,做传代细胞的分化鉴定.结果培养出大鼠胚胎神经干细胞.荧光显微镜下检测感染逆转录病毒的神经干细胞,以及免疫组化鉴定,均显示EGFP获得良好表达;而且感染细胞能够被诱导分化为神经元和神经胶质细胞.结论大鼠胚胎神经干细胞能够在体外适宜的条件下进行长期培养;神经干细胞可直接作为基因靶细胞;利用逆转录病毒载体,建立稳定表达EGFP的神经干细胞系具有可行性,为进一步做标记细胞移植研究奠定基础.
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抑制Rac1的活性对人肝癌细胞生长及侵袭能力的影响
目的 探讨抑制人肝癌细胞HepG2中Rac1的活性对其生长及侵袭能力的影响.方法 应用逆转录病毒载体,将Rac1基因的阴性突变体Rac1N17导入HepG2细胞,经嘌呤霉素筛选后获得表达Rac1N17的阳性细胞克隆Rac1N17-HepG2,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,四甲基偶氮唑(MTT)法检测细胞增殖抑制并绘制细胞生长曲线,细胞基质黏附实验检测对细胞的黏附能力的影响,Transwell法检测细胞侵袭能力的改变.结果 荧光镜下可见绿色荧光蛋白主要分布于HepG2细胞核中,在细胞质中也有少量表达,证实了病毒栽体质粒转染成功.MTT法表明Rac1的活性抑制后,HepG2细胞的增殖能力无明显变化(P>0.05);细胞基质黏附实验显示HepG2细胞与基质的黏附能力随着时间的延长而逐渐减弱(P<0.05);Transwell侵袭实验结果 显示Rac1的活性抑制后,Rac1抑制组穿过PET滤膜的HepG2细胞数明显少于对照组(P<0.05),表明其侵袭能力明显受抑制.结论 Rac1基因在肝癌细胞的黏附、侵袭及过程中发挥重要的作用,有望成为肝细胞癌基因治疗新的靶点.
