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逆转录病毒载体携带自杀基因对晶状体上皮细胞的抗增生作用
围绕后发性白内障防治的实验研究是当前眼科研究的热点之一.现代白内障术后,残留的晶状体上皮细胞向后囊表面增生和移行,在后发性白内障的发生过程中起着重要作用.基因疗法为疾病的治疗开辟了一条新途径,有着广阔的前景.本实验用逆转录病毒载体携带自杀基因(HSV-tk基因)导入晶状体上皮细胞,随后再给予丙氧鸟苷(ganciclovir,GCV),观察其对晶状体上皮细胞的影响,以期为将来后发性白内障的基因治疗奠定基础.
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小鼠Ar18a基因逆转录病毒载体MSCV-GFP-Ar18a的构建
目的:克降小鼠Ar18a(mAr18a)cDNA,构建带有检测标签的逆转录病毒载体系统,并检测由该病毒系统介导的mAr18a基因在骨髓来源树突状细胞中的表达.方法:从培养的小鼠骨髓来源树突状细胞中提取总RNA,通过RT-PCR扩增出mAr18a基因片段,再将其克隆入pDrive克隆载体并测序.然后将mAr18a目的基因插入逆转录病毒载体MSCV-GFP中,以磷酸钙法转染294T包装细胞,收集病毒卜清感染树突状细胞后,通过流式细胞术检测mAr18a的表达.结果与结论:成功克隆了mAr18a的cDNA,并成功构建其重组逆转录病毒载体MSCV-GFP-Ar18a,该载体可有效将Ar18a基因转移到骨髓米源的树突状细胞中,转染效率达28.3%.
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大鼠前脑啡肽原基因逆转录病毒表达载体及产毒细胞系的建立
目的:构建大鼠前脑啡肽原基因(pENK)逆转录病毒载体,获得携带该基因的高滴度产毒细胞系.方法:应用RT-PCR方法获得大鼠pENK基因,HindⅢ、Cla Ⅰ双酶切后,同相应双酶切的pLNCX2载体大片段连接,构建成pENK基因逆转录病毒载体pLNCX2-pENK.然后用脂质体法将该载体转染PT67细胞,G418筛选,并进行滴度测定.结果与结论:成功地构建了pLNCX2-pENK载体,获得8×108CFU/L的产毒细胞系.成功建立了携带pENK的高滴度逆转录病毒产毒细胞系.
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逆转录病毒载体介导的RNAi对MCF-7细胞E2F1 mRNA表达的影响
目的:采用逆转录病毒载体介导的RNAi技术靶向抑制乳癌细胞MCF-7 E2F1 mRNA的表达.方法:构建重组的表达E2F1siRNA的逆转录病毒载体.将重组载体和空载体转染入MCF-7细胞中,共分9组:空载体组、未转染组和7个转染组.筛选出稳定转染的单克隆细胞扩大培养.应用RT-PCR方法检测转染细胞和未转染细胞E2F1 mRNA的表达情况.结果:筛选出7个转染逆转录病毒载体的单克隆,命名为SIR1～7,其E2F1 mRNA表达量分别为0.857±0.015,0.850±0.037,0.907±0.029,0.878±0.021,0.900±0.021,0.912±0.031,0.913±0.023;转染空载体和未转染的细胞E2F1 mRNA表达量分别为1.563±0.031和1.544±0.018;SIR1～7 E2F1 mR-NA表达量低于空载体及未转染组,差异有统计学意义(P＜0.05),SIR1～7 E2F1 mRNA表达均受到抑制;SIR1～7之间以及空载体转染与未转染组之间差异无统计学意义(P＞0.05).结论:逆转录病毒载体介导的RNAi技术特异、高效抑制靶基因的表达,为肿瘤基因治疗提供了新的思路和工具.
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hTERT启动子调控的HSV-tk基因逆转录病毒载体的构建及SKOV3转染细胞的生物学特性观察
目的:观察转染有人端粒酶逆转录酶基因(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)启动子调控的单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶(herpes simplex virus thymidine kinase, HSV-tk)基因的人卵巢癌细胞的部分生物学特性.方法:构建hTERT启动子调控的HSV-tk基因重组逆转录病毒载体,筛选携带该载体的包装细胞,测定包装细胞产生的逆转录病毒滴度,并用病毒颗粒感染人卵巢癌SKOV3细胞(SKOV3/tk细胞)并经RT-PCR方法鉴定.然后倒置显微镜下观察SKOV3/tk细胞形态,MTT法研究细胞生长特性,并观察转染细胞裸鼠体内的成瘤能力.结果:包装细胞产生的病毒滴度可达2×103 cfu·ml-1.SKOV3/tk细胞扩增出770 bp 的tk基因片段,形态与SKOV3细胞无明显差异;倍增时间72 h,无明显变化;裸鼠体内的成瘤能力较SKOV3细胞下降.结论:hTERT调控的HSV-tk基因逆转录病毒载体构建成功;转染细胞的裸鼠体内成瘤能力降低.
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EGFP逆转录病毒载体构建及在人骨髓间质干细胞中的表达
目的:构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)逆转录病毒载体,转染人骨髓间质干细胞(hMSCs),探讨EGFP作为组织工程种子细胞示踪剂的可行性.方法:构建携带EGFP基因的逆转录病毒载体,用阳离子脂质体介导法将病毒质粒导入包装细胞,取阳性包装细胞克隆的病毒上清感染hMSCs,筛选稳定表达EGFP的细胞克隆(hMSCs-EGFP),MTT法测定hMSCs-EGFP的生长曲线.结果:病毒上清转染hMSCs后,绿色荧光蛋白能稳定表达一个月以上,生长曲线显示转基因细胞增殖速度和未转染细胞无明显差别.结论:hMSCs转染EGFP后,不影响其生长,EGFP可作为组织工程种子细胞良好的示踪剂.
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hTERT-逆转录病毒载体构建及其在脐血间质干细胞中的表达
目的:构建hTERT-逆转录病毒载体,向脐血间质干细胞(UCBMSCs)中导入hTERT基因,观察该基因的表达.方法:PCR法扩增出hTERT全部片断,定向克隆入pLNCX2载体.将病毒质粒导入包装细胞内,筛选阳性产毒细胞,测定病毒滴度.取病毒上清感染脐血MSCs,筛选转基因细胞,检测转染前后hTERT在mRNA水平的表达.结果:用BglⅡ和NotⅠ双酶切构建质粒,证明PLNCX2-hTERT构建成功,转基因细胞的hTERT基因在mRNA水平得到表达.结论:hTERT-逆转录病毒载体构建成功,在逆转录病毒介导下,外源性hTERT基因转入脐血MSCs后得到表达.
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炎症性肠病相关基因逆转录病毒表达载体的构建
目的 构建炎症性肠病相关基因(major histocompatibility complex class I chain-related gene A,MICA)逆转录病毒表达载体pCLXSN-MICA,为进一步研究MICA基因的功能奠定基础.方法 根据MICA基因的核苷酸序列,设计并合成引物,通过RT-PCR方法 ,从含有MICA基因的Hela细胞中,扩增该基因外显子片段,与逆转录病毒表达载体pCLXSN连接,构建MICA基因的逆转录表达载体,并进行鉴定.结果 构建的新质粒经PCR、酶切鉴定和DNA测序,证实新质粒构建成功.结论 重组MICA逆转录病毒表达载体的构建为进一步研究MICA在炎症性肠病等自身免疫性疾病的作用奠定了基础.
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稳定干扰核糖体蛋白RPS7基因表达的宫颈癌HeLa细胞株的建立
目的 建立稳定抑制RPS7基因表达的宫颈癌HeLa细胞株.方法 设计并合成靶向人RPS7基因的shRNA寡核苷酸片段,克隆到逆转录病毒载体pSIREN中,构建重组质粒pSIREN-RPS7-shRNA,转染293T细胞,将包装产生的重组逆转录病毒感染宫颈癌HeLa细胞,经嘌呤霉素筛选获得稳定的细胞克隆,用real-time PCR和Western印迹检测细胞中RPS7 mRNA和蛋白表达水平.结果 获得了经测序鉴定正确的重组逆转录病毒质粒,逆转录病毒感染HeLa细胞后用嘌呤霉素筛选出的稳定细胞中,RPS7 mRNA和蛋白水平均显著低于干扰对照细胞.结论 成功构建了靶向人RPS7基因的shRNA逆转录病毒载体,建立了稳定抑制RPS7基因表达的宫颈癌HeLa细胞株,为进一步研究RPS7在宫颈癌中的生物学功能和作用机制提供了可靠的细胞模型.
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LMO3逆转录病毒表达载体的构建及其对SK-N-AS细胞增殖的影响
目的 构建包含LMO3 ( LIM-only 3,LMO3)全长基因的逆转录病毒表达载体,感染人神经母细胞瘤SK-N-AS,检测LMO3对SK-N-AS细胞增殖的影响.方法 将质粒pEGFP-C1-LMO3经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后亚克隆至逆转录病毒载体pLXSN,构建重组逆转录病毒表达载体pLXSN-LMO3,导入包装细胞pA317,获得逆转录病毒颗粒,感染SK-N-AS细胞,用RT-PCR及Western 印迹鉴定,检测LMO3感染后细胞的增殖及细胞周期分布情况.结果 获得了能正确表达LMO3基因的重组逆转录病毒表达载体pLXSN-LMO3;LMO3基因被逆转录病毒成功导入SK-N-AS细胞后,与对照组细胞相比,LMO3感染组G0/G1期细胞减少,S期细胞增加,感染48 h后,LMO3感染组细胞的增殖能力显著高于空载体对照组及SK-N-AS组(P＜0.05).结论 成功构建了LMO3基因的逆转录病毒表达载体,LMO3可以通过促进SK-N-AS细胞由G0/G1期进入S期,从而促进细胞的增殖.
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用pLNCX2携带人MCPH1基因shRNA重组逆转录病毒载体的构建及鉴定
目的 建立逆转录病毒介导的MCPH1基因RNA干扰表达体系并观察其在宫颈癌Caski细胞中对MCPH1表达的影响.方法 将人MCPH1基因RNA干扰双链DNA片段重组到逆转录病毒质粒pLNCX2中,构建携带人MCPH1基因RNA干扰的逆转录病毒载体pLNCX2-shRNA-MCPH1,经PT67细胞包装后,产生的重组逆转录病毒感染宫颈癌细胞株Caski细胞,并用G418筛选产生稳定的细胞克隆,用RT-PCR和Western印迹检测细胞中MCPH1 mRNA和蛋白表达的变化.结果 重组逆转录病毒质粒经测序鉴定正确,逆转录病毒感染Caski细胞后用G418筛选出稳定的细胞克隆,RT-PCR和Western印迹检测人MCPH1 mRNA和蛋白表达水平明显低于阴性对照组和未干扰组.结论 携带人MCPH1基因RNA干扰双链DNA片段的逆转录病毒感染Caski细胞后能明显抑制MCPH1 mRNA和蛋白表达,为进一步研究MCPH1在宫颈癌中的作用奠定了基础.
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逆转录病毒载体介导的猪瘟病毒E2基因的真核表达
利用DNA重组技术将猪瘟病毒(Classical swine fever virus , CSFV)石门株囊膜蛋白E2基因插入逆转录病毒载体pBABE-puro 中构建成重组逆转录病毒载体pBABE-puro-E2,该重组逆转录病毒载体与pVSVg质粒经磷酸钙共转染法将其转入293GP细胞中包装逆转录病毒假病毒.用包装的假病毒感染PK-15细胞,经嘌呤霉素筛选阳性细胞后进行流式细胞技术(FACS)分析,结果表明CSFV E2基因在PK-15细胞膜上成功表达.将表达E2蛋白的PK-15细胞腹腔免疫Balb/c小鼠,成功诱导小鼠产生了抗E2蛋白的抗体.
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逆转录病毒载体介导的HCV囊膜蛋白基因的表达及动物免疫试验
利用DNA重组技术将丙型肝炎病毒(HCV)H77株E1E2囊膜蛋白基因插入逆转录病毒载体pBABE-puro中构建成重组逆转录病毒载体pBABE-puro-E1E2,该重组逆转录病毒载体与pVSVg质粒经磷酸钙共转染法将其转入293T细胞中包装逆转录病毒假病毒.用包装的假病毒感染SP2/0细胞,经嘌呤霉素筛选阳性细胞后进行流式细胞技术(FACS)分析,结果表明HCV ele2基因在SP2/0细胞膜上成功表达.将表达E1E2蛋白的SP2/0细胞腹腔免疫BALB/c小鼠,经FACS分析免疫鼠血清,成功诱导小鼠产生了抗HCVE1E2蛋白的抗体,Western blot表明该抗体能与原核系统表达的E2蛋白结合.
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反义RNA抑制猪传染性胃肠炎病毒复制的研究
根据反义RNA作用原理,设计一条互补猪传染性胃肠炎病毒基因(26888-27184)区的反义RNA序列.将该序列与逆转录病毒表达载体构建成质粒PLXSN-N5',并与质脂体共转染PA317细胞,经G418(500μg/ml)筛选出稳定的产毒细胞克隆.取其上清液感染小鼠成纤维细胞NIH3T3,测定细胞克隆产生的假病毒滴度,用高滴度假病毒感染IBRS2细胞.提取被感染的IBRS2细胞总DNA和RNA,通过PCR和RT-PCR证明PLXSN-N5'整合到IBRS2细胞基因组.病毒感染细胞病变表明,反义RNA有明显抑制TGEV复制的作用.
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反义前S/S基因转移表达抗乙型肝炎病毒的研究
为了观察反义基因转录表达抗乙型肝炎病毒(HBV)的作用,将HBV ayw前S/S基因(preS/S)片段反向插入逆转录病毒载体质粒,构建preS/S反义基因重组体,经转染PA317细胞后,获得重组逆转录病毒颗粒.用重组病毒转导2.2.15细胞后,第3天即可见细胞培养上清HBV表面抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)表达量减少,到转导后第5天,细胞培养上清中的HBsAg和HBeAg表达量降到低水平,HBsAg抑制率为71%,HBeAg抑制率为27%,抑制作用至少可持续到转导后第11天.空载及正向插入基因的重组逆转录病毒转导对2.2.15细胞内HBV抗原表达无抑制作用.
关键词： 乙型肝炎病毒(HBV) 基因治疗 逆转录病毒载体 -
Ku80基因RNAi逆转录病毒载体的构建及稳定转染人肾癌786-O细胞株的建立
目的 构建并鉴定逆转录病毒介导的Ku80基因RNA干扰表达体系,并建立稳定、高效、长久低表达Ku80的人肾癌786-O细胞株.方法 针对Ku80基因,设计并合成3对特异性RNA干扰靶序列,退火形成双链DNA,与BglⅡ和Hind Ⅲ双酶切后的pSUPERretro-puro载体连接,构建pSUPERretro-puro-siKu80干扰表达载体,并对重组载体进行测序鉴定.筛选出基因沉默效应强的干扰序列后使用磷酸钙法共转染293FT细胞,产生的病毒颗粒随后感染786-O细胞,经嘌呤霉素筛选得到阳性克隆.用RT-PCR检测Ku80基因mRNA表达,Western blot测定转染后786-O细胞中Ku80蛋白的表达量,以鉴定稳定细胞株.结果 测序结果证实目的 片断正确插入pSUPERretro-puro表达载体中,成功构建了pSUPERretro-puro-siKu80干扰表达载体,稳定转染干扰表达载体的786-O细胞Ku80基因的表达显著降低.结论 成功构建了抑制Ku80基因表达的逆转录病毒载体,并获得Ku基因稳定干扰的人肾癌786-O细胞株,为下一步利用小干扰RNA技术研究肾癌的基因治疗奠定了基础.
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Desmuslin基因过表达对曲张静脉源性平滑肌细胞增殖及迁移功能的影响
目的 通过Desmuslin (DMN)重组逆转录病毒表达载体感染曲张大隐静脉源性平滑肌细胞(SMCs),观察上调DMN的表达后对SMCs功能的影响,探讨DMN与下肢静脉曲张发生发展的关系.方法 贴块法行曲张静脉源性SMCs原代培养,免疫荧光细胞化学法鉴定SMCs的纯度;分别运用已制备好平均滴度为(2.80±1.46)×106 cfu/ml的pRetroQ-AcGFP1-C1-DMN重组逆转录病毒与pRetroQ-AcGFP1-C1空载逆转录病毒感染SMCs;实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)及Western blot检测转染效率;细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测比较SMCs的增殖活性;Transwell技术检测SMCs的迁移活性.结果 免疫荧光细胞化学法显示特异性的平滑肌α-肌动蛋白(α-actin)染色阳性的细胞数占总细胞数的99％以上;DMN过表达组的DMN mRNA水平为空载组的(8.3±1.1)×104倍(P＜0.01),DMN蛋白表达为空载组的(4.5±1.2)倍(P＜0.01);DMN过表达组SMCs增殖活性为空载组的(48.2±4.5)％(P＜0.01);DMN过表达组细胞的迁移活性为空载组的(44.3±4.7)％(P＜0.01).结论 在曲张静脉源性SMCs中上调DMN的表达后显著抑制SMCs的增殖及迁移活性,DMN蛋白可能在下肢静脉曲张的发生发展中起着重要作用.
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Desmuslin基因逆转录病毒表达载体的构建及包装细胞株的建立
目的 构建Desmuslin (DMN)基因的逆转录病毒表达载体,并建立其包装细胞株.方法 聚合酶链式反应(PCR)扩增DMN基因的全长编码框(约3700 bp),PCR产物(PCR-DMN)亚克隆至逆转录病毒载体pRetroQ-AcGFP1-C1,构建DMN基因的逆转录病毒表达载体pRetroQ-AcGFP1-C1-DMN,酶切及测序鉴定后,把重组质粒通过转染导入包装细胞株PT67,嘌呤霉素筛选后获得抗性克隆,293细胞进行病毒颗粒滴度测定.结果 pRetroQ-AcGFP1-C1-DMN克隆的酶切鉴定和测序鉴定结果表明DMN基因的全长编码框被准确克隆至载体pRetroQ-AcGFP1-C1,其序列与理论序列完全一致;获取了稳定产生DMN逆转录病毒的PT67细胞克隆株,其产生的病毒原液平均病毒滴度为(2.80±1.46)×106 cfu/ml.结论 成功构建了Desmuslin基因逆转录病毒表达载体并建立了其包装细胞株.
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pLXSN-胶质细胞源性神经营养因子重组载体转染脐带间充质干细胞的研究
目的 构建大鼠胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因修饰的脐带间充质干细胞(UCMSCs).方法 鉴定重组体中目的基因.脂质体包裹法将pLXSN-GDNF(携带大鼠胶质细胞源性生长因子的重组逆转录病毒载体)包装到PA317细胞中.NIH3T3细胞测定逆转录病毒滴度.病毒转染增殖旺盛的UCMSCs.免疫组织化学染色法和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测GDNF基因的表达.结果 目的基因正确.脂质体包裹法成功将pLXSN-GDNF载体转染入包装细胞PA317中.NIH3T3细胞测定高病毒滴度为1×104 CFU/mt.免疫组织化学染色结果示:GDNF-UCMSCs抗GDNF蛋白染色阳性.RT-PCR结果示:转染后GDNF-UCMSCs表达GDNF mRNA的水平明显高于未转染的UCMSCs,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 成功构建GDNF基因修饰的UCMSCs.
关键词： 胶质细胞源性神经营养因子 脐带间充质干细胞 逆转录病毒载体 -
转录因子E2F-1对裸鼠人胃癌细胞移植瘤生长的影响
目的 观察含有转录因子E2F-1的重组逆转录病毒载体(pLXSN-E2F-1)对裸鼠人胃癌细胞移植瘤E2F-1基因的表达和肿瘤生长的影响.方法 建立人胃癌MCC-803细胞裸鼠移植肿瘤模型,随机分为pLXSN-E2F-1组、pLXSN组、生理盐水组.隔天向各组分别注射相应药物0.2 ml,共7次,同时测量各组肿瘤体积.15 d后处死裸鼠,显微镜下观察移植瘤组织形态变化,用免疫组织化学法、半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot技术检测移植瘤中E2F-1基因的表达,脱氧核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)检测肿瘤细胞凋亡指数.结果 与生理盐水组和pLXSN组比较.pLXSN-E2F-1组肿瘤生长速度明显减慢(P<0.05);病理学观察确认所取组织为恶性肿瘤组织;免疫组织化学结果 显示pLXSN-E2F-1组的肿瘤细胞细胞质内有较多棕褐色颗粒沉着,pLXSN组和生理盐水组肿瘤细胞细胞质内均未见或偶见棕褐色颗粒沉着;半定量RT-PCR和Western blot结果 均显示pLXSN-E2F-1组E2F-1表达较pLXSN组和生理盐水组明显上调(P<0.05);pLXSN-E2F-1组的凋亡指数(15.4±4.1)%,显著高于pLXSN组(8.3±2.2)%和生理盐水组(8.1±2.3)%(P<0.05).结论 逆转录病毒载体pLXSN-E2F-1瘤内注射可抑制人胃癌裸鼠移植瘤的生长.
