人骨髓间质干细胞的培养及成骨功能研究

目的体外扩增人骨髓间质干细胞(human bone marrow-derived mesonchymal stem cells, hBMMSCs),研究其生物学特征及体内、外成骨功能.方法分离培养hBMMSCs,并对其形态、增殖动力学、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)表达及体内、外成骨功能进行研究.结果 hBMMSCs可在体外培养扩增,群体倍增时间约为3.5 d.ALP检测表明,未经矿化诱导的hBMMSCs可表达少量ALP,诱导后其表达量明显增高.von kossa 染色证实在矿化诱导液作用下hBMMSCs在体外可形成钙结节.体内成骨实验证实,1×105个hBMMSCs接种到30 mm3块状 HA/TCP载体移植BAL B/C裸小鼠皮下3个月,可观察到层板状骨组织生成.结论 hBMMSCs是一种具有成骨潜能的前体细胞,经培养、扩增、诱导后,在体外可形成矿化结节,体内可在载体表面形成骨组织.

高浓度他克莫司抑制人骨髓间质干细胞增殖及向成骨细胞分化

目的 探讨他克莫司(FK506)对人骨髓间质干细胞 (hBMSCs)增殖及向成骨细胞分化的影响.方法 FK506 0.001～5 μmol·L-1处理hBMSCs细胞中,雌二醇0.01 μmol·L-1或咖啡因100 μmol·L-1为阳性对照组,作用24 h后用BrdU掺入法检测细胞增殖,在促成骨细胞分化液中作用8 d后用比色法检测碱性磷酸酶(ALP)活性,作用12 d后用邻甲酚酞络合法检测钙沉积量;通过检测磷酸盐释放量间接反映钙调神经磷酸酶(CaN)活性,Western 印迹法检测核心结合因子α1亚基 (Cbfα1)表达.结果 与DMSO对照组相比,FK506 0.001～0.01 μmol·L-1促进细胞增殖,但对ALP活性及钙沉积量无影响;FK506 0.5～5 μmol·L-1则呈浓度依赖性地抑制细胞增殖,显著抑制ALP活性及减少钙沉积量(P<0.05).此外,FK506 0.1～5 μmol·L-1呈浓度依赖性地降低CaN活性,与相同浓度FK506 呈浓度依赖性地下调Cbfα1的表达效应相一致.结论 高浓度FK506可通过CaN/Cbfα1通路抑制hBMSCs增殖及向成骨细胞成骨分化.

低细胞密度状态下的人骨髓间质干细胞成骨能力研究

目的研究低密度人骨髓间质干细胞(Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells,hMSCs)体内成骨能力及影响因素.方法从人髂骨骨髓分离培养hMSCs.以不同细胞密度与块状和颗粒型磷酸钙陶瓷(HA/TCP)载体混合,移植于裸小鼠体内,分别观察2和3个月,组织学评价研究hMSCs异体体内成骨的小细胞密度.按3.3×10 6个细胞/cm3载体的比例混合细胞与载体(HA/TCP和鼠尾胶原包被的HA/TCP),体外共培养一周后移植裸鼠皮下,3个月后,组织学评价细胞载体体系体外培养和胶原包被载体对hMSCs体内成骨能力的影响.结果只有以3.3×106个细胞/cm3载体在体内移植3个月后可观察到在块状和颗粒HA/TCP表面有骨组织生成.用鼠尾胶原包被的颗粒HA/TCP和细胞与载体体外共培养并无明显促进骨组织生成作用.结论保证hMSCs异体成骨的小细胞密度为3.3×10 6个细胞/cm3载体.在低密度hMSCs状态下,鼠尾胶原和细胞与载体体外共培养并不能提高hMSCs的成骨能力.

超声心动图在大鼠梗死心肌重建实验中的应用

目的应用超声心动图技术,探讨人骨髓间质干细胞移植于大鼠梗死心肌后的作用.方法在M型超声心动图上,对实验组和对照组大鼠进行左心腔大小,室间隔、室壁心肌厚度,收缩运动幅度及左室射血分数测量.结果实验组的室间隔运动明显优于对照组,两组室间隔与左室后壁运动幅度之比存在显著性差异.结论实验组室间隔心肌收缩运动改善.提示人骨髓间质干细胞有心肌重建的作用,超声心动图可用于大鼠心脏实验研究.

人骨髓间质干细胞ING4基因的克隆及其慢病毒表达载体构建

目的:克隆人骨髓间质干细胞ING4(inhibitor of growth famility,member4)基因,构建其慢病毒表达载体PNL-ING4.方法:提取人骨髓间质干细胞(hMSCs)总RNA,经RT-PCR扩增出ING4cDNA,克隆至PMD19-T载体,选择阳性克隆进行酶切鉴定和测序,构建慢病毒表达载体PNL-ING4,用双酶切、基因测序进行鉴定.结果:RT-PCR产物为750 bp的条带,双酶切和基因测序正确.结论:成功从hMSCs克隆了ING4基因并成功构建其慢病毒表达载体PNL-ING4,为进一步研究ING4基因的作用与抗肿瘤机制奠定了基础.

人骨髓间质干细胞治疗实验性变态反应性脑脊髓炎大鼠的实验研究

目的:研究尾静脉注射入骨髓间质干细胞(hMSCs)移植治疗实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)大鼠的疗效及移植后hMSCs在EAE大鼠体内的状况.方法:分离和纯化hMSCs.用豚鼠脑脊髓匀浆免疫Wistar大鼠制备EAE大鼠模型,分别在免疫后10、15、21天经尾静脉注射移植未分化的hMSCs入大鼠体内,通过电镜,动物模型神经功能评分,病理观察hMSCs对EAE大鼠的疗效,利用免疫组化方法观察移植后的hMSCs在EAE大鼠体内存活、迁徙、分化的状况.结果:免疫后10天和15天hMSCs移植组大鼠自移植后10天起其神经功能评分显著低于对照组(P＜0.05);在电镜下治疗组髓鞘超微结构改变明显轻于对照组;病理上各移植组在移植后10、30天脑内脱髓鞘病灶数目明显少于对照组(P＜0.05).hMSCs移植组各时间点大鼠脑组织切片中均可见Brdu、NSE、GFAP、CNPase染色阳性细胞,CNPase(+)的少突胶质细胞比例随时间的延长而逐渐增多.结论:hMSCs移植能有效改善EAE动物的神经功能评分,减少脱髓鞘病灶数目,并且在体内微环境改变信号的影响下分化成神经元、星型胶质细胞、少突胶质细胞.

EGFP逆转录病毒载体构建及在人骨髓间质干细胞中的表达

目的:构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)逆转录病毒载体,转染人骨髓间质干细胞(hMSCs),探讨EGFP作为组织工程种子细胞示踪剂的可行性.方法:构建携带EGFP基因的逆转录病毒载体,用阳离子脂质体介导法将病毒质粒导入包装细胞,取阳性包装细胞克隆的病毒上清感染hMSCs,筛选稳定表达EGFP的细胞克隆(hMSCs-EGFP),MTT法测定hMSCs-EGFP的生长曲线.结果:病毒上清转染hMSCs后,绿色荧光蛋白能稳定表达一个月以上,生长曲线显示转基因细胞增殖速度和未转染细胞无明显差别.结论:hMSCs转染EGFP后,不影响其生长,EGFP可作为组织工程种子细胞良好的示踪剂.

人骨髓间质干细胞移植趋向小鼠脑胶质瘤的研究

目的 检测通过颈动脉注射人骨髓间质细胞(hMSCs)移植趋向小鼠脑胶质瘤.方法 分离培养hMSCs,检测其CD73、CD105和CD90的表达；分析U87细胞条件培养基对体外hMSCs迁徙的作用,测定U87细胞培养液上清中转化生长因子(TGF)-β1和血管内皮生长因子(VEGF)的表达；通过颈动脉注射移植携带绿色荧光蛋白(GFP)的hMSCs,观察其向裸小鼠U87脑移植瘤模型趋向及肿瘤新生血管的生成情况.结果 分离培养的hMSCs呈长梭形、折光性强的成纤维样细胞形态,高表达CD73、CD105和CD90; U87条件培养基可以促进hMSCs的细胞迁移,在培养3d时,U87细胞培养上清的TGF-β1为(0.633±0.096) μg/L,而VEGF为(4.065±0.189) μg/L;将GFP标记的hMSCs通过颈动脉注射移植,3d后在裸小鼠脑内可观察到带有绿色荧光的细胞.结论 颈动脉注射移植的hMSCs能够趋向迁徙到裸小鼠脑胶质瘤,可能与肿瘤分泌的细胞因子相关.

硝酸甘油促进人骨髓间质干细胞增殖分化实验研究

目的:探讨硝酸甘油(Nitroglycerin,NTG)对人骨髓间质干细胞(Human Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells,HBMSCs)的增殖及向成骨细胞分化的影响及其作用机制.方法:建立HBMSCs体外模型,诱导HBMSCs向成骨细胞分化.给予不同浓度的NTG,测定一氧化氮(NO)含量,考察不同浓度NTG对HBMSCs的NO生成的影响;用BrdU细胞增殖试剂盒测定反映细胞的增殖情况;测定细胞内碱性磷酸酶(ALP)活性与钙沉积量,反映不同浓度NTG对HBMSCs向成骨细胞分化的影响,探讨NO和ALP及钙沉积之间的关系;根据以上实验选出NTG小有效浓度,再合用内皮型一氧化氮合酶(Endothelial nitric oxide synthase,eNOS)拮抗剂以及诱导型一氧化氮合酶(Induciable nitric oxide synthase,iNOS)拮抗剂探讨NTG作用于HBMSCs的机制是否与NOS有关.结果:NTG呈剂量依赖性的增加原代HBMSCs的增殖、NO含量、ALP活性及钙沉积量.NTG 10 μM对HBMSCs增殖及成骨型分化的诱导作用以及对HBMSCs的NO产量和NOS活性的影响不能被eNOS抑制剂L-NAME及iNOS桔抗剂1 400 W所阻滞.结论:NTG可通过NO途径促进HBMSCs的增殖及其向成骨细胞的分化,但其释放NO的效应并不依赖NOS.

骨组织工程中人骨髓间质干细胞动态种植和静态种植的比较研究

分别采用动态种植(旋转烧瓶法)和静态种植方法种植人骨髓间质干细胞,于种植后的两周内测定细胞-载体构件中DNA含量;利用组织学光镜和扫描电镜观察细胞的分布情况;运用荧光标记RT-PCR技术测定相关成骨基因的表达.构件中DNA含量测定表明,对于静态种植,当初始种植密度为每载体400×103(8.9×104/mm3)时,DNA的含量达到高;在此基础上提高初始种植密度,并不能进一步提高构件DNA含量.光镜和扫描电镜观察可见动态种植后人骨髓间质干细胞在载体中的分布相对均匀,静态种植后细胞在载体中出现聚集现象;荧光标记RT-PCR证明,体外构件培养两周后,动态种植后的细胞-载体构件中有较多的成骨基因表达.提示人骨髓间质干细胞的静态种植效率较低;动态种植是一种优于静态种植的可行方法.

人骨髓间质干细胞作为骨、软骨组织工程种子细胞的实验研究

骨髓间质干细胞诱导成骨细胞成骨能力的实验研究

目的:研究人骨髓间质干细胞(BMSCs)诱导成骨细胞的成骨能力,为组织工程化骨应用于临床提供理论依据.方法:制备人BMSCs与犬脱细胞-脱钙骨的复合物,将复合物回植于裸鼠皮下作为实验组,同时植入空白材料作为对照组,分别于植入4、8、12周取材,进行大体观察和组织切片HE染色观察,分析其体内成骨能力.结果:大体观察:随着植入时间延长,实验组体积变化不明显,12周时材料与背部皮肤粘连;对照组体积略缩小,材料基本降解.组织切片HE染色观察见对照组无新骨形成,有纤维包裹,实验组8、12周时有新骨小梁形成,周围有较多小血管形成.结论:人BMSCs诱导的成骨细胞具有良好的体内成骨能力,脱细胞-脱钙骨松质-人BMSCs-成骨细胞是较理想的组织工程化骨.

人骨髓间质干细胞向成骨细胞诱导分化条件的建立

目的:探讨体外诱导培养人骨髓间质干细胞(BMSCs)向成骨细胞分化的方法和技术,为骨组织工程研究提供理想的种子细胞.方法:抽取无系统疾病自愿捐献骨髓患者的骨髓,体外分离诱导培养BMSCs,按照诱导条件加入时间的先后次序分为早期诱导组(A组)和延迟诱导组(B组),镜下观察2组细胞形态学变化,计算倍增时间,并测定2组骨钙素的含量和Ⅰ型胶原的表达,研究该细胞生物学特性及其体外成骨能力.结果:(1)镜下观察:A组细胞贴壁,呈菱形,5～7 d融合,成纤维细胞集落样生长;B组细胞贴壁,呈梭形,3～5 d融合,呈指纹状生长方式.(2)倍增时间:A组第1、2、3、4代倍增时间分别为18.86、17.45、18.71、20.99 h;B组第1、2、3代倍增时间分别为17.54、19.59、25.46 h,第4代停止生长,2组各代倍增时间差异均有统计学意义(P＜0.05).(3)骨钙素:A组各代均可检测到骨钙素,Ⅰ型胶原自原代就有阳性表达,第3、4代细胞达到强;B组原代、第1代细胞中未检测到骨钙素,诱导后才分泌骨钙素,Ⅰ型胶原各代均有阳性表达,但不均匀,第4代细胞停止增殖,无阳性表达.结论:应用成骨细胞条件培养液在体外能够促进人BMSCs向成骨细胞分化,验证了BMSCs是一种比较理想的骨组织工程种子细胞.早期诱导是较为完善的体外诱导培养条件和方法.