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地塞米松对牙囊细胞表达Runx2、Osterix的体外研究
目的 研究地塞米松对体外培养的小鼠牙囊细胞Runx2和Osterix mRNA表达的影响,探讨Runx2和Osterix在牙囊细胞成骨分化中的作用.方法 原代培养大鼠牙囊细胞,取生长状态良好的第4代大鼠牙囊细胞分别与实验组中浓度为10-8 mol/L地塞米松以及未加入地塞米松的对照组共培养,第7天、14天、21天提取细胞mRNA,RT-PCR检测Runx2、Osterix的mRNA表达,以GAPDH作为内参物,比较两组PCR产物的光密度值.结果 与对照组比较,加入地塞米松的实验组,Runx2 mRNA在三个不同时间点的表达增强(P＜0.01),Osterix mRNA表达提前,在第14天、21天时表达强于对照组(P＜0.01).结论 地塞米松可增强小鼠牙囊细胞Runx2和Osterix mRNA的表达水平,提示地塞米松促进牙囊细胞向成骨方向的分化.
关键词： 牙囊 地塞米松 核心结合因子α1亚基 Osterix -
Wnt/LRP5/β-catenin信号通路在绝经后骨质疏松发病中的作用
目的 探讨Wnt/LRPS/β-catenin信号通路在绝经后骨质疏松发病中的作用.方法 选取50只6月龄雌性Wistar大鼠,随机分为对照组(n=24)和去卵巢组(n=26),去卵巢组大鼠行双侧卵巢切除术,对照组打开大鼠腹腔后不作任何处理即缝合.去卵巢后0、4和8周分别测定两组大鼠血雌二醇水平和骨密度,4和8周用逆转录-PCR技术检测骨组织中低密度脂蛋白受体相关蛋白5( LRP5)、β连环蛋白(β-catenin)及骨形成关键基因—runt相关基因2(Runx2)mRNA的表达.结果 去卵巢组大鼠术后4和8周,出现雌二醇水平明显下降,术后4周时为( 92±15) pmol/L,对照组为( 117±29) pmol/L；术后8周时为(95±22) pmol/L,对照组为(114±15) pmol/L；两组分别比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).术后4周时去卵巢组骨密度为(0.076±0.016) g/cm2,对照组为(0.098 +0.016) g/cm2;术后8周时去卵巢组为(0.052±0.013) g/cm2,对照组为(0.095±0.028)g/cm2；两组分别比较,差异均有统计学意义(P＜0.01).去卵巢组大鼠术后4周骨组织中LRP5、β-catenin和Runx2 mRNA表达水平明显减少,分别为0.97±0.04、0.58±0.05、0.86±0.03,对照组为1.02±0.06、1.04±0.05、1.07±0.21,两组各指标分别比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 Wnt/LRP5/β-catenin信号通路抑制可能是绝经后骨质疏松重要发病机制之一.
关键词： 骨质疏松 绝经后 β连环素 LDL受体相关蛋白质类 核心结合因子α1亚基 雌二醇 -
高浓度他克莫司抑制人骨髓间质干细胞增殖及向成骨细胞分化
目的 探讨他克莫司(FK506)对人骨髓间质干细胞 (hBMSCs)增殖及向成骨细胞分化的影响.方法 FK506 0.001～5 μmol·L-1处理hBMSCs细胞中,雌二醇0.01 μmol·L-1或咖啡因100 μmol·L-1为阳性对照组,作用24 h后用BrdU掺入法检测细胞增殖,在促成骨细胞分化液中作用8 d后用比色法检测碱性磷酸酶(ALP)活性,作用12 d后用邻甲酚酞络合法检测钙沉积量;通过检测磷酸盐释放量间接反映钙调神经磷酸酶(CaN)活性,Western 印迹法检测核心结合因子α1亚基 (Cbfα1)表达.结果 与DMSO对照组相比,FK506 0.001～0.01 μmol·L-1促进细胞增殖,但对ALP活性及钙沉积量无影响;FK506 0.5～5 μmol·L-1则呈浓度依赖性地抑制细胞增殖,显著抑制ALP活性及减少钙沉积量(P<0.05).此外,FK506 0.1～5 μmol·L-1呈浓度依赖性地降低CaN活性,与相同浓度FK506 呈浓度依赖性地下调Cbfα1的表达效应相一致.结论 高浓度FK506可通过CaN/Cbfα1通路抑制hBMSCs增殖及向成骨细胞成骨分化.
关键词： 他克莫司 人骨髓间质干细胞 钙调神经磷酸酶 核心结合因子α1亚基 -
活化T细胞核因子c1在慢性肾衰竭大鼠血管钙化中的作用
目的 探讨活化T细胞核因子c1(NFATc1)在慢性肾衰竭大鼠血管钙化中的作用.方法 将19只雄性SD大鼠随机分为3组:假手术组6只(甲基纤维素灌胃)、慢性肾衰竭组6只(5/6肾切除+甲基纤维素灌胃)、慢性肾衰竭血管钙化组7只(5/6肾切除+甲基纤维素灌胃+骨化三醇灌胃).采用yon Kossa染色方法和邻甲酚酞络合酮比色法测定检测大鼠主动脉钙化情况;免疫组织化学方法检测大鼠主动脉NFATc1蛋白表达情况.体外原代培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞(VSMCs),用β-甘油磷酸(β-GP)诱导钙化.将细胞随机分为3组:正常对照组、钙化组(10 mmol/Lβ-GP)和环孢素A(CsA)干预组[高磷培养基基础上添加CsA(调整浓度为1μg/ml)].采用茜素红染色及邻甲酚酞络合酮比色法检测细胞钙化情况;酶联免疫吸附法检测细胞碱性磷酸酶(ALP)活性;RT-PCR和Western印迹法检测NFATc1、Runt相关转录因子2(Runx2)的表达.结果 体内实验结果显示,与假手术组和慢性肾衰竭组相比,慢性肾衰竭血管钙化组的大鼠主动脉NFATc1免疫组化评分较高(7.20±0.46比1.52±0.77、2.04±1.31,均P＜0.05).体外实验结果显示,高磷环境成功诱导了VSMCs钙化发生;RT-PCR和Western印迹结果显示钙化组VSMCs的NFATc1和Runx2表达高于正常对照组(均P＜0.05);CsA干预后VSMCs钙盐沉积减少[(60.86±7.95)比(107.20±11.07) mg/g,P＜0.05],Runx2表达(mRNA和蛋白水平)及ALP活性亦降低[(48.63±3.02)比(98.75±3.46) U/g,P＜0.05].结论 NFATc1在慢性肾衰竭大鼠血管钙化发生中可能起促进作用,其作用机制可能与促进VSMCs成骨样表型转化有关.
关键词： NFATC转录因子类 钙质沉着症 肌 平滑 血管 肾功能衰竭 慢性 核心结合因子α1亚基 -
Akt/mTOR在高磷诱导的血管平滑肌细胞钙化中的表达及对核心结合因子的调节
目的 观察蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Akt/mTOR)在高磷诱导的大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)钙化模型中的表达及其对核心结合因子α1(Cbfα1)表达的调节.方法 体外培养的大鼠VSMC,分为正常磷组(1.3 mmol/L)和高磷组(2.6 mmol/L),培养7d后,观察细胞形态及茜素红染色细胞钙盐沉积,实时定量PCR检测Cbfα1、骨桥蛋白(OPN) mRNA水平,Western印迹检测磷酸化Akt(p-Akt)(ser473)、磷酸化mTOR(p-mTOR)(S2448)、Cbfα1和OPN蛋白的表达.检测到Akt、mTOR活化表达后,给予不同浓度的渥曼青霉素(5、10、30、50和100 nmol/L)和雷帕霉素(1、10和100 ng/ml)干预24、48 h后,检测Cbfα1、OPN、p-Akt和p-mTOR基因和蛋白表达,7d后观察VSMC钙盐沉积变化.结果 VSMC高磷干预7d后,与正常磷组相比,高磷组钙盐沉积明显,Cbfα1、OPN mRNA表达增高(均P＜0.05),p-Akt、p-mTOR、Cbfα1和OPN蛋白表达增高(均P＜0.05).渥曼青霉素、雷帕霉素干预24 h后,相对于高磷组,高磷+渥曼青霉素30、50、100 nmol/L组Cbfα1、OPNmRNA表达明显下调(均P＜0.05);高磷+雷帕霉素1、10和100 ng/ml组Cbfα1、OPN mRNA表达下调(均P＜0.05).渥曼青霉素、雷帕霉素干预48 h后,与高磷组比较,高磷+渥曼青霉素30、50、100 nmol/L)组p-Akt、Cbfα1和OPN蛋白表达明显下调(均P＜0.05);高磷+雷帕霉素1、10、100 ng/ml组,p-mTOR、Cbfα1和OPN蛋白表达呈剂量依赖性下调(均P＜0.05).VSMC培养7d后,与高磷组相比,高磷+渥曼青霉素和高磷+雷帕霉素组钙盐沉积明显减轻.结论 高磷可体外诱导大鼠VSMC钙化,Akt、mTOR参与了高磷诱导的大鼠VSMC钙化,并可能通过调控Cbfα1因子而起作用.
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核心结合因子α-1基因沉默对高磷诱导的血管平滑肌细胞钙化的影响
目的 研究核心结合因子α-1(Cbfα-1)基因沉默对高磷诱导的血管平滑肌细胞(VSMC)成骨样分化和钙化的影响.方法 体外原代培养大鼠VSMC.针对大鼠Cbfα-1基因设计合成4对候选小分子干扰RNA(siRNA)序列,以Lipo 2000为载体,转染体外培养的VSMC;FAM荧光标记siRNA优化转染条件.反转录(RT)-PCR检测Cbfα-1 mRNA表达,筛选有效siRNA序列.将有效siRNA序列转染VSMC,细胞分为4组:(1)正常磷组(1.3 mmol/L);(2)高磷组(2.6 mmol/L);(3)siRNA转染组:高磷+Cbfα-1-siRNA;(4)阴性转染对照组:高磷+阴性对照siRNA.RT-PCR和Western印迹法检测Cbfα-1、骨桥蛋白(OPN)基因和蛋白表达;茜素红染色观察细胞钙盐沉积.结果 在Cbfα-1-siRNA浓度为100nmol/L、Lipo为8μl/孔转染条件下,转染效率约55％;筛选佳干扰序列Cbfα-1 siRNA1952,转染24 h沉默效率可达81.8％.与高磷组相比,siRNA转染组Cbfα-1 mRNA表达在转染后24和48 h均明显低于高磷组(24 h:0.335 ±0.059比0.714 ±0.106,48 h:0.574 ±0.036比0.726±0.086,均P＜0.01);Cbfα-1蛋白表达在转染后48和72 h均显著低于高磷组(均P＜0.01),以48 h明显.siRNA有效沉默Cbfα-1基因表达后,siRNA转染组OPN mRNA和蛋白的表达明显低于高磷组(均P＜0.05),且细胞钙盐沉积亦明显低于高磷组.结论 化学合成的Cbfα-1 siRNA可有效抑制VSMC Cbfα-1基因和蛋白的表达,从而抑制高磷诱导的VSMC成骨样转分化和细胞钙化.Cbfα-1可望成为CKD血管钙化治疗的靶点.
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体外冲击波对早中期股骨头坏死患者骨髓间质干细胞生物学特性的影响
目的 观察体外冲击波(extracorporeal shock wave,ESW)对早中期股骨头坏死(osteonecrosis of the femoral head,ONFH)患者骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)成骨及成脂相关基因表达的影响.方法 取ONFH患者自愿捐赠的骨髓.体外分离并传代培养MSCs.将P_3代MSCs分为A组(干预组)和B组(对照组);细胞计数试剂盒检测P_3代MSCs不同时间点增殖差异;酶细胞化学和茜素红染色检测P_3代MSCs碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)含量和P_7代MSCs胞外基质矿化程度的差异;RT-PCR检测不同时间点骨钙素(osteocalcin,OC)、核心结合因子α1(core-binding factor alpha 1,Cbfα1)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ,PPARγ)表达量的差异.结果 A组各时间点(不含第1天)细胞增殖速度均明显强于B组;ALP含量(不含第3天)A组总体水平明显高于B组;茜素红染色示A组矿化结节数为(6.0±1.0)个/视野,B组始终为阴性;Cbfα1在成骨分化的整个过程中均持续表达,A组在各时间点(不含第3天)均明显强于B组;A组OC在各时间点(不舍第3、6天)均明显强于B组;PPARγ在成骨分化的整个过程中均持续表达.A组在各时间点(不含第3天)均明显弱于B组.结论 适当强度的ESW能够促进MSCs增殖,诱导MSCs向成骨细胞方向分化并抑制MSCs向成脂细胞方向分化是其治疗ONFH的有效机制.
关键词： 高能量冲击波 股骨头坏死 核心结合因子α1亚基 骨钙素 -
镁离子对大鼠血管平滑肌细胞钙化的影响
目的：探讨不同浓度镁离子对大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)钙化的影响。方法原代培养获取VSMCs，进行形态学及免疫细胞鉴定，后将VSMCs随机分为阴性对照组、高磷组、镁干预组。阴性对照组采用含10%胎牛血清培养，高磷组采用高磷培养基培养，镁干预组在高磷培养基的基础上分别加入不同浓度氯化镁，使镁离子终浓度分别为1、2、3 mmol/L（镁干预组1~3），刺激7 d后行钙化检测，测定钙含量及碱性磷酸酶（ALP）活性，并行反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测细胞内核心结合因子α1（Cbfα1）mRNA的表达。结果高磷组和镁干预组VSMCs均有钙盐沉积，其钙含量均高于阴性对照组；镁干预组随镁离子浓度增大钙化结节逐渐缩小，除镁干预组1钙含量与高磷组差异无统计学意义外，镁干预组2和镁干预组3均低于高磷组（均P＜0.05）。VSMCs ALP活性和Cbfα1 mRNA的表达除镁干预组3与阴性对照组差异无统计学意义外，其余组均高于阴性对照组（P＜0.05）。镁干预组随镁离子浓度增大，ALP活性和Cbfα1 mRNA的表达水平均逐渐降低，且均低于高磷组（P＜0.05）。结论镁离子可在一定程度上抑制高磷诱导的VSMCs钙化和成骨样转分化，其可能是通过降低VSMCs中Cbfα1的表达来实现的。
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镁离子在高磷诱导慢性肾衰竭大鼠胸主动脉血管钙化中的作用及机制研究
目的：探讨镁离子在高磷诱导慢性肾衰竭大鼠模型血管钙化中的作用及其机制。方法将32只雄性SD大鼠采用随机数字表法均分为对照组（ A组）、慢性肾衰竭血管钙化组（ B1组）、低镁组（ B2组）、高镁组（ B3组）。用硫酸腺嘌呤加高磷饮食复制慢性肾衰竭大鼠血管钙化模型。造模成功后测量4组大鼠主动脉脉搏波速率（PWV），反转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测主动脉血管钙化标志分子核心结合因子α1（Cbfα1）mRNA的表达情况，von Kossa染色及邻甲酚酞络合酮比色法测定钙水平。结果 B1组血肌酐、尿素氮、血磷水平高于A组（ t=32.284、22.010、26.000，P<0.05）。4组血镁水平比较，差异有统计学意义（F=7.745，P<0.05）；B3组血镁水平高于B2组（q=2.897，P<0.05）。4组主动脉钙水平比较，差异有统计学意义（F=6.824，P<0.05）；B2组主动脉钙水平高于B1组（q=13.192，P<0.05）；B1组主动脉钙水平高于A组（q=21.925，P<0.05）；B3组主动脉钙水平低于B1组和B2组（q=9.333、21.782，P<0.05）。4组胸主动脉PWV值比较，差异有统计学意义（F=6.454，P<0.05）；B2组PWV值高于B1组（q=13.492，P<0.05）；B1组PWV值高于A组（q=14.311，P<0.05）；B3组PWV值低于B1组和B2组（q=5.333、16.865，P<0.05）。4组胸主动脉Cbfα1 mRNA表达量比较，差异有统计学意义（F=3.212，P<0.05）；B1和B2组Cbfα1 mRNA表达量高于A组（q =7.333、13.565，P <0.05）；B3组 Cbfα1 mRNA表达量低于B1组和B2组（q=10.198、13.858，P<0.05）；B2组Cbfα1 mRNA表达量高于B1组（q=12.279， P<0.05）。结论镁离子能够抑制高磷诱导的慢性肾衰竭大鼠血管钙化，改善血管弹性功能；其可能机制之一是镁离子通过抑制高磷诱导血管平滑肌细胞表型转化实现。
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白细胞介素6对体外培养人脐动脉平滑肌细胞成骨样转化、钙化的影响
目的 研究白细胞介素6(IL-6)对体外培养人脐动脉平滑肌细胞(HUASMC)成骨样转化、钙化的作用及可能的信号通路.方法 组织植块法原代培养HUASMC.培养基加入不同浓度重组人IL-6(rhIL-6)孵育细胞,设空白对照组.茜素红S钙沉积染色及甲氧.酚酞络合酮法榆测细胞层钙盐含量.实时定量PCR、荧光定量法以及Western印迹法分别检测骨特异性碱性磷酸酶(BAP)、骨桥蛋白(OPN)、骨形成蛋白2(BMP2)和骨保护素(OPG)基因以及蛋白表达.凝胶迁移滞后实验(EMSA)检测核心结合因子α1亚基(Cbfα1)的结合活力,以及分别应用p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)抑制剂SB203580和蛋白激酶C二氢神经鞘氨醇(DHC)后Cbfα1的结合活力.结果 rhlL-6 50μg/L诱导12 d,细胞基质层茜素红S染色阳性.与对照组相比,细胞层钙盐含量在rhIL-6 10 μg/L组刺激9 d[(0.76+0.02)mmol/g蛋白]和12 d[(1.54±0.11)mmol/g蛋白]升高,50μg/L组刺激6 d[(1.81±0.03)mmol/g蛋白]、9 d[(2.08±0.10)mmol/g蛋白]和12 d[(3.22±0.18)mmol/g蛋白]升高,并呈时间、剂量依赖地增加.rhIL-6 10μg/L刺激12 h,BMP2 mRNA(3.04±0.07)和蛋白(8.14±0.41)及BAP mRNA(2.51±0.11)和蛋白(3.96±0.54)表达上调;刺激72 h,OPN mRNA(3.14±0.32)和蛋白(2.57±0.43)水平及OPG mRNA(4.06±0.24)和蛋白(3.46±0.34)水平上调.rhIL-6刺激6 h,Cbfα1结合活力增加;DHC能够部分抑制rhIL-6诱导的Cbfα1结合活力增加,SB203580没有明显作用.结论 IL-6体外能够诱导HUASMC发生钙化和成骨样转分化,这可能是临床观察到IL-6与血管钙化相关的机制之一.IL-6的这一作用可能与细胞内蛋白激酶C通路的活化有关.
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核心结合因子和Ⅱ型胶原在慢性肾脏病5期患者桡动脉中的表达
目的 探讨慢性肾脏病(CKD)5期患者桡动脉中核心结合因子(Cbfα-1)和Ⅱ型胶原(Col Ⅱ)表达及其与血管钙化发生的关系.方法 40例CKD5期患者在接受动-静脉内瘘手术时,留取一段桡动脉.对10例在本院接受胃大部切除术、肾功能正常患者,留取一段胃左动脉为对照组.钙盐沉积采用von Kossa染色法,根据von Kossa染色结果,CKD5期组又分为CKD5期无钙化组、轻中度钙化组和重度钙化组.Cbfα-1和ColⅡ的表达采用免疫组化染色法.同时测定血钙、磷、甲状旁腺激素(iPTH)、C反应蛋白(CRP)水平.结果 40例CKD5期患者中有17例(42.5％)出现血管钙化,主要发生在血管中膜,对照组均未见血管钙化发生.CKD5期轻中度钙化组和重度钙化组中,动脉中膜均有Cbfα-1、ColⅡ的阳性表达；23例CKD5 期无钙化组中,有18例(78.3％)至少有Cbfα-1、ColⅡ其中一种的阳性表达.对照组均无Cbfα-1、C0lⅡ的阳性表达.CKD5期轻中度钙化组和重度钙化组,血管中膜Cbfα-1、ColⅡ免疫组化的阳性率均显著高于CKD5期无钙化组,但轻中度钙化组和重度钙化组之间的差异无统计学意义.CRP、钙磷乘积与Cbfα-1、ColⅡ呈正相关；血磷与Cbfα-1(r=0.786,P＜0.01)、ColⅡ(r=0.785,P＜0.01)呈正相关.结论 CKD5期患者桡动脉钙化以中膜为主,钙化的动脉均有Cbfα-1、Col Ⅱ的高表达,且其表达早于组织学上血管钙化的发生.Cbfα-1和ColⅡ可能在血管钙化的发生、发展中起到了重要作用.
